TINJAUAN PUSTAKA

2.7 Tinjauan Tentang Urin

Urin atau air seni atau air kencing adalah cairan sisa yang diekskresikan oleh ginjal yang kemudian akan dikeluarkan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Ekskresi urin diperlukan untuk membuang molekul- molekul sisa dalam darah yang disaring oleh ginjal dan untuk menjaga homeostasis cairan tubuh. Urin disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter menuju kandung kemih, akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra.

Urin secara kontinyu dibentuk oleh ginjal. Fungsi utama urin adalah untuk membuang zat sisa seperti racun atau obat-obatan dari dalam tubuh. Komposisi urin berubah sepanjang proses reabsorpsi ketika molekul yang penting bagi tubuh, misal glukosa, diserap kembali ke dalam tubuh melalui molekul pembawa.

Umumnya, urin terdiri dari urea dan bahan-bahan organik maupun anorganik lain yang terlarut dalam air. Variasi dalam konsentrasi senyawa- senyawa tersebut dapat terjadi sebagai akibat dari faktor seperti asupan makanan, aktivitas fisik, metabolisme tubuh, fungsi endokrin, dan bahkan posisi tubuh. Urea, sisa produk metabolisme, dihasilkan di hati dari pemecahan protein dan asam amino, terhitung hampir setengah dari total komponen yang terlarut dalam urin. Senyawa organik lain termasuk kreatinin dan asam urat. Komponen anorganik utama yang terlarut yakni klorida, natrium dan kalium.

Sejumlah kecil bahan-bahan tambahan anorganik lain juga terdapat dalam urin. Konsentrasi dari senyawa-senyawa anorganik tersebut sangat Sejumlah kecil bahan-bahan tambahan anorganik lain juga terdapat dalam urin. Konsentrasi dari senyawa-senyawa anorganik tersebut sangat

Urin normal memiliki volume sekitar 600-2500 ml dalam 24 jam, rata-rata 1200 ml, dengan pH normal sekitar 4,6-8,0 (rata-rata pH 6,0). Urin segar nampak jernih hingga sedikit berkabut, berwarna kuning pucat- kuning sawo, dan berbau khas (Fischbach, 2000).

2.7.1 Validitas Data Urin

Untuk mendapatkan studi ekskresi kumulatif melalui urin yang valid pada pemberian obat dosis tunggal maka harus dipenuhi kriteria sebagai berikut ( Ritschel, 1986 ):

1. Obat harus diekskresikan melalui ginjal paling sedikit 10% dalam bentuk tidak berubah (utuh).

2. setelah berpuasa semalam, satu jam sebelum percobaan dimulai, subjek diberi minum 400 ml air untuk pengosongan kandung kemih. Kemudian 200 ml air diberikan bersama-sama dengan pemberian obat, diikuti dengan 200 ml setiap selang waktu satu jam selama empat jam berikutnya.

3. Segera sebelum pemberian obat, kandung kemih harus dikosongkan dan urin dipakai sebagai blanko.

4. Untuk masing-masing sampel urin yang didapat harus dicatat dengan tepat volume dan waktunya.

5. Jika urin tidak langsung dianalisis, maka urin sebanyak 20-25 ml diberikan pengawet sebanyak 0,5-1 ml toluen dan segera dimasukkan lemari es.

6. Semua cuplikan urin setiap waktu harus dikumpulkan, tidak boleh ada yang hilang.

7. Urin harus dikumpulkan sampai semua obat dalam bentuk tidak berubah terekskresi sempurna. Oleh karena itu maka paling sedikit pengambilan sampelnya selama 7-10 kali waktu paruh eliminasinya.

2.8 Tinjauan Tentang LC-MS/MS

Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran berdasarkan pada perbedaan migrasi masing-masing analit senyawa pada fase diam dibawah pengaruh fase gerak. Dasar pemisahan kromatografi adalah terjadinya perubahan dari sistem kesetimbangan distribusi statik molekul senyawa ke sistem kesetimbangan distribusi dinamik diantara fase diam dan fase gerak yang berkesinambungan. Karena molekul analit pada kondisi variabel kromatografi tertentu mempunyai tetapan kesetimbangan distribusi dinamik yang khas, maka akan terjadi pola pemisahan yang tetap (Yuwono, 2009)

Pengetahuan dasar tentang LC-MS/MS diperoleh dari panduan primer tentang LC-MS yang di keluarkan oleh perusahaan Agilent, yaitu sebagai berikut:

Kromatografi cair merupakan dasar teknik pemisahan di bidang sains dan terkait dengan kimia. Kromatografi cair dapat dengan aman memisahkan senyawa organik dengan rentang yang sangat luas yaitu mulai dari metabolit obat dengan molekul kecil sampai peptida dan protein.

Detektor umum dari kromatografi cair termasuk indeks refraksi, elektrokimia, fluoresensi, dan ultraviolet-visible (UV-Vis). Beberapa dari detector tersebut memberikan data dua dimensi yaitu data yang menunjukkan

fungsi atas waktu. Detektorfluorosensi dan diode-array UV-Vis menghasilkan data tiga dimensi yaitu tidak hanya kekuatan signal namun data spectra dari masing- masing poin waktu. Mass spectrometers juga menghasilkan data tiga dimensi. Selain kekuatan signal juga menghasilkan data massa spektral yang dapat memberikan informasi berharga tentang struktur, berat molekul, identifikasi, jumlah, dan kemurnian sampel. Data spektral massa menambahkan spesifitas yang meningkatkan kepercayaan dalam hasil dari analisis baik kualitatif dan kuantitatif. Untuk sebagian besar senyawa yang di analisis dengan spektrometer massa jauh lebih sensitif dan lebih spesifik daripada semua LC detektor lainnya. Hal ini dapat menganalisis senyawa yang tidak memiliki kromofor yang cocok. Hal ini juga dapat mengidentifikasi komponen dalam kromatografi dengan peak yang belum terselesaikan, mengurangi kebutuhan untuk kromatografi yang sempurna.

Data spektral massa melengkapi data dari detektor LC lainnya. Sementara ketika dua senyawa mungkin memiliki spektrum UV yang sama atau spektrum massa yang sama, hal ini jarang terjadi bagi mereka untuk memiliki keduanya. Dua set data ortogonal dapat digunakan untuk Data spektral massa melengkapi data dari detektor LC lainnya. Sementara ketika dua senyawa mungkin memiliki spektrum UV yang sama atau spektrum massa yang sama, hal ini jarang terjadi bagi mereka untuk memiliki keduanya. Dua set data ortogonal dapat digunakan untuk

2.8.1 Instrumentasi

Spektrometer massa bekerja dengan molekul peng-ion dan kemudian menyortir dan mengidentifikasi ion sesuai dengan massa-muatan (m/z) rasio. Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion yang menghasilkan ion, dan analiser massa, yang menghasilkan berbagai macam ion. Beberapa berbagai jenis sumber ion umumnya digunakan untuk LC/MS. Masing-masing cocok untuk berbagai kelas senyawa. Beberapa yang berbeda jenis dari analiser massa juga digunakan. Masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian tergantung pada jenis informasi yang dibutuhkan.

2.8.2 Sumber Ion.

Pengenalan teknik atmospheric pressure ionization (API) dengan jumlah senyawa yang sangat besar dapat berhasil dianalisis oleh LC / MS. Dalam atmospheric pressure ionization molekul analit yang terionisasi terlebih dahulu pada tekanan atmosfer. Ion analit kemudian secara mekanis dan elektrostatis dipisahkan dari molekul netral. Teknik atmospheric pressure ionization (API) secara umum adalah:

 Electrospray ionization (ESI)  Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)  Atmospheric pressure photoionization (APPI)

Gambar 2.11 Penerapan berberapa teknik ionisasi LC/MS

2.8.3 Mass Analyzers (Analiser massa).

Meskipun dalam teori apapun jenis analiser massa dapat digunakan untuk LC / MS ada empat jenis:

 Quadrupole  Time-of-flight  Ion trap  Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR or FT-MS)

paling sering digunakan. digunakan. Masing-masing memiliki kelebihan dan kerugian tergantung pada persyaratan dari analisis tertentu.

2.8.4 Collision-Induced Dissociation and Multiple-Stage MS

(Disosiasi induksi tabrakan dan tahap-tahap MS) Teknik atmospheric pressure ionization (API) yang dibahas adalah semua teknik yang relatif lunak. Terutama menghasilkan:

+ atau M • Molekul ion M - • Molekul terprotonasi [M+H] + • Ion adisi sederhana [M+Na] + • Ion yang mewakili kehilangan yang sederhana seperti hilangnya air

[M+H-H 2 O] + Informasi tentang berat molekul yang dihasilkan sangat berharga, namun informasi struktural pelengkap sering dibutuhkan. Untuk memperoleh informasi struktural, ion analit yang terfragmentasi karena bertabrakan dengan molekul netral dalam proses yang dikenal sebagai collision induced dissociation (CID) atau collisionally activated dissociation (CAD). Tegangan yang diterapkan pada ion analit untuk menambah energi untuk tabrakan dan menciptakan fragmentasi lebih banyak.

Multiple-stage MS (juga disebut tandem MS atau MS / MS atau MSN) adalah cara yang efektif untuk mendapatkan informasi struktur. Dalam instrumen tiga-quadrupole atau quadrupole / quadrupole / time-of- flight, quadrupole yang pertama digunakan untuk memilih ion prekursor. CID mengambil tempat di tahap kedua (quadrupole atau octopole), yang disebut sel tabrakan (collision cell).

Gambar 2.12 MS/MS dengan spektrometer massa triple-quadrupole.

Tahap ketiga (quadrupole atau FPT) maka menghasilkan spektrum yang dihasilkan produk ion. Hal ini juga dapat melakukan pemantauan ion terpilih dari hanya beberapa ion produk ketika mengkuantifikasi senyawa target. Dalam perangkap ion dan FT-ICR spektrometer massa, semua ion kecuali ion prekursor yang diinginkan dikeluarkan dari perangkap. Prekursor ion kemudian diberikan energi dan tabrakan untuk menghasilkan produk ion. Ini adalah teknik yang sangat kuat untuk menentukan struktur molekul.

Keuntungan utama dari multiple-stage MS adalah kemampuan untuk menggunakan tahap pertama dari MS untuk membuang ion non- analit. Pembersihan sampel dan pemisahan kromatografi menjadi kurang kritis. Dengan sampel relatif murni sangatlah umum untuk melakukannya lebih jauh dengan pemisahan kromatografi secara bersamaan dan menginjekkan sampel langsung ke spektrometer massa untuk memperoleh spektrum produk massal untuk karakterisasi atau konfirmasi. Penentuan informasi tentang struktur metabolit dari flavonoid glikosida Gendarusin A secara efektif dapat ditentukan dengan spektrometer massa MS/MS triple- quadrupole ini.

2.8.5. Kolom Kromatografi

Kolom dengan kinerja yang tinggi yang dapat digunakan secara luas untuk pemisahan sampel merupakan jantung dari modern kromatografi cair.

1. Kolom untuk kiral kromatografi yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa kiral (isomer) yang mempunyai kolom packing seperti α-acid glycoprotein, cellulose tris (3,5- dimethylphenylcarbamate), vancomycin. Kolom yang ter-packing dengan α-acid glycoprotein merupakan jenis kolom kiral yang dapat memisahkan enansiomer (optis aktif) dan dapat bekerja secara stereoselektif (Corre et al, 1988). Vancomycin pada silica yang berfungsi sebagai sebagai chiral stationary phase (CSP) dapat memisahkan enansiomer dengan fase organik yang polar. (Svensson et al, 2000).

2. Kolom silika C-18 merupakan standar emas yang digunakan untuk RP-HPLC dengan material packing alkil yang lebih pendek C12 dan C8, kolom nitril (medium-polarity) untuk analit polar serta alkil yang lebih panjang seperti kolom C30 untuk obat yang hidrofobik. Octadecyl-silica (ODS) atau C-18 dapat digunakan secara luas untuk pemisahan mulai dari mikroanalisis sampai isolasi skala besar (Holcapek et al, 2008).

3. Kolom monolitik memiliki permeabilitas tinggi yang dapat digunakan kecepatan alir yang lebih tinggi sehingga mengurangi waktu kromatografi. Kolom monolitik biasa terbuat dari polimer berpori yang cross-linked atau silica berpori (Nobuo et al, 2003).

2.9 Metode Analisis Gendarusin A dalam Urin

Metode ekstraksi gendarusin A dalam urin untuk cara ekstraksi 1 (Moh Sihabbudin, 2009): 500 μl urin blanko dan sampel dideproteinisasi dan diekstraksi ditambah 1.000 μl metanol, lalu diultrasonikasi selama 15 menit. Sampel kemudian divortex selama 5 menit lalu disentrifuse dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dikumpulkan pada tabung yang berbeda, proses tersebut diulang dua kali hingga didapatkan kurang lebih 2 ml supernatan. 2,5 ml supenatan tersebut dipekatkan menggunakan gas nitrogen lalu direkonstitusi kembali dengan 500 μl metanol dan diultrasonikasi selama 10 menit. Setelah disentrifuse pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit, supernatant disaring menggunakan membran filter nylon 0,2 μm kemudian 20 μl supernatant diinjeksikan ke dalam HPLC. Fase diam kolom C18 dan fase gerak metanol:asam fosfat 0,2 % dengan sistem eluasi gradien. Kecepatan alir fase gerak diatur 1 ml/menit dan suhu kolom diatur pada 30 °C. Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang 270 nm.