HASIL PENELITIAN
BAB V HASIL PENELITIAN
5.1 Pemilihan Kondisi HPLC (preliminary)
5.1.1 Hasil Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum
Senyawa marker gendarusin A memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 270 nm dan 340 nm. Panjang gelombang terpilih adalah 340 nm karena memiliki serapan gendarusin A maksimal dan mempunyai lebih sedikit pengganggu.
Gambar 5.1 Spektra 2D gendarusin A yang menunjukkan panjang gelombang
maksimum pada 340 nm
Gambar 5.2 Kromatogram HPLC standar gendarusin A 32 ppm pada berbagai panjang gelombang [A] 340 nm [B] 254 nm dan [C] 270 nm
5.1.2 Hasil Pemilihan Fase Gerak
Fase gerak terpilih adalah sistem gradien metanol/air karena memberikan waktu retensi gendarusin A yang optimal yang tidak terlalu lama dan terpisah dari matriks urin yang mempunyai banyak komponen.
Tabel 5.1 Fase gerak HPLC gendarusin A Waktu
Persentase
(menit ke-)
Metanol
Air
(%)
(%)
0 10 90
5 40 60
9 60 40 9,5
10 90
Gambar 5.3 Kromatogram HPLC gendarusin A 32 ppm dalam berbagai komposisi fase gerak. [A] fase gerak isokratik 30 % metanol/air, [B] sistem
gradien metanol/air, kecepatan alir 1 ml/menit, suhu oven 30 0
C, panjang gelombang 340 nm
5.2 Hasil Pemilihan Metode Preparasi Sampel Urin
Metode ekstraksi gendarusin A dalam urin yang terpilih adalah sebagai berikut:
1. Sampel 2-5 ml urin (masing-masing poin waktu pengumpulan urin terpilih dan akumulasi urin selama 24 jam) ditambah metanol (1:1, v/v), lalu diultrasonikasi selama 15 menit dalam tabung.
2. Sampel divortex selama 1 menit lalu disentrifuse dengan kecepatan 4.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh
dikumpulkan pada tabung yang berbeda.
3. Proses ultrasonifikasi dan vortex tersebut (tahap 1 dan tahap 2) diulang dua kali. Lalu disentrifuge kembali dengan kecepatan
5.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dikumpulkan menjadi satu tabung.
4. Supenatan dipekatkan menggunakan gas nitrogen lalu direkonstitusi kembali dengan 1 ml metanol dan diultrasonikasi
selama 15 menit.
5. Sampel divortex selama 3 menit dan di sentrifuse 4000 rpm selama
5 menit bila masih ada endapan
6. Supernatan disaring menggunakan membran filter nylon 0,2 μm kemudian diinjeksikan ke LC-MS/MS.
urin + metanol (1:1, v/v)
Ultrasonifikasi 15 menit, Vortex 1 menit, Sentrifuge 4000 rpm 15 menit
Filtrat (supernatan) Endapan & sisa pelarut
Ultrasonifikasi 15 menit, vortex 1 menit, sentrifuse 5.000 rpm 10 menit
Filtrat (supernatan) Endapan
Dipekatkan dengan gas nitrogen
Residu (kering) Dilarutkan dalam 1 ml metanol Ultrasonifikasi 15 menit, vortex 3 menit,
(sentrifuse 4000 rpm 5 menit)
Endapan
Filtrat (supernatan)
Saring dengan membran filter nylon Whatmann 0,2 um
Siap dianalisis dengan LC-MS/MS
Gambar 5.4. Skema ekstraksi gendarusin A pada sampel urin
5.3 Hasil Optimasi Metode Kualitatif
5.3.1 Selektivitas
Selektivitas menunjukkan keterpisahan yang baik antara gendarusin A dengan komponen lain di dalam matriks urin. Waktu retensi Selektivitas menunjukkan keterpisahan yang baik antara gendarusin A dengan komponen lain di dalam matriks urin. Waktu retensi
Gambar 5.5 Kromatogram HPLC [A] blanko urin [B] standar gendarusin A
5.3.2 Persen Rekoveri
Persen rekoveri dilakukan dengan menggunakan standar gendarusin A konsentrasi 6,4 ppm dan 25,6 ppm. Dari tabel dapat diketahui rata-rata persen rekoveri dari dua konsentrasi tersebut adalah 94,91 %. Persen rekoveri digunakan untuk menguji metode yang digunakan apakah sudah menghasilkan perolehan kembali yang optimal. Menurut syarat kuantitatif persen rekoveri adalah 80-110 % (Huber, 2004). Persen rekoveri diusahakan mendekati penelitian kuantitatif untuk menghasilkan persen perolehan kembali yang optimal.
Tabel 5.2 Rekoveri standar gendarusin A dalam urin blanko
Konsentrasi Rekoveri (ug/ml)
% rekoveri
Rata-rata (%)
5.4 Hasil Optimasi Menggunakan LC-MS/MS QTRAP 4000 Series
5.4.1 Hasil Tunning Awal
Hasil tuning menunjukkan fragmentasi dari standar gendarusin A dan apigenin (bentuk aglikon gendarusin A) yang dimiliki. Fragmentasi tersebut menampilkan data dalam bentuk m/z (masa / muatan) yaitu apigenin m/z 269 Da dan gendarusin A m/z 533 Da.
Gambar 5.6 Profil LC-MS/MS standar apigenin dengan m/z 269 Da CE 40.
Gambar 5.7 Profil LC-MS/MS standar gendarusin A [A] kelimpahan ion tertinggi
di m/z 117 Da CE 100 [B] standar gendarusin A m/z 533 Da CE 50.
5.4.2 Hasil Pemilihan Fase Gerak LC-MS/MS
Fase gerak terpilih pada LC-MS/MS adalah sistem gradien 10 mmol/L ammonium asetat dan 0,1 % asam format dalam aquadest dan 10 mmol/L ammonium asetat dan 0,1 % asam format dalam metanol karena memberikan waktu retensi yang singkat dan sensitivitas yang bagus.
Tabel 5.3 Fase gerak sistem gradien LC-MS/MS
10 mmol/L ammonium (menit)
Waktu
10 mmol/L ammonium
asetat dan 0,1 % asam asetat dan 0,1 % asam format dalam aquadest
format dalam metanol
Gambar 5.8 Kromatogram LC-MS/MS standar apigenin. Kecepatan alir
Gendarusin A 2.09
Gendarusin A 2.09
Isomer
5.4.3 Perhitungan LOD/LOQ
Tabel 5.4 Perhitungan LOD dan LOQ
Konsentrasi Intensitas Rata-rata intensitas (ppb)
4768,571 y = 3,145 x – 27,169
CCα = 2,33 x 0,506 = 1,179 ppb r = 0,9927
CCβ = 1,179 + (1,64 x 0,506) SD = 1578,592
= 2,009 ppb
rata-rata = 3118,095 RSD = 0,506
Dari slope persamaan regresi standar gendarusin A ditentukan RSD (residual standar deviation) intensitas gendarusin A, sehingga dapat ditentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasinya (LOQ). Dari hasil perhitungan didapatkan LOD (limit of detection) adalah 1,179 ppb dan LOQ (limit of quantification) adalah 2,009 ppb. Adapun perhitungannya dapat dilihat di tabel 5.4.
5.4.4 Efek Matriks
Efek matriks diperoleh dari standar gendarusin A 2,84 ppm sebelum dan sesudah preparasi (pre spike and post spike) dengan konsentrasi sama adalah sebesar 98,97 %. Karena hasilnya kurang dari 100% sehingga ada sedikit efek penekanan ion (ion suppression) pada analisis. (Hughes et al, 2010)
Gambar 5.10 Kromatogram LC-MS/MS pre / post spike standar gendarusin
A dalam urin blanko.
5.5 Identifikasi Metabolit Gendarusin A dalam Urin
Hasil identifikasi metabolit gendarusin A dalam urin menunjukkan hanya subyek dengan inisial C BAY dari 4 subyek yang digunakan teridentifikasi gendarusin A dalam urin dengan konsentrasi yang sangat kecil mendekati LOD dari alat.
Gambar 5.11. Kromatogram LC-MS/MS identifikasi gendarusin A dalam urin subyek [A] AST dan [B] BAG
Gendarusin A
Gendarusin A
Gambar 5.12. Kromatogram LC-MS/MS identifikasi gendarusin A dalam urin subyek [C] BAY dan [D] DYC.