DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK P (1)

SKRIPSI

DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f

WILDAN ALFIAN NOOR FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA 2012

SKRIPSI

DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f

WILDAN ALFIAN NOOR NIM: 050810231 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA 2012

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

Dengan perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya dengan judul:

“DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f ”

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet, digital library Perpustakaan Universitas Airlangga atau media lain untuk kepentingan akademik sebatas sesuasi dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi skripsi/karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Surabaya, 28 September 2012

Wildan Alfian Noor NIM: 050810231

iii

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini, Nama : Wildan Alfian Noor NIM

: 050810231 Fakultas: Farmasi menyatakan dengan sesungguhnya bahwa hasil tugas akhir yang saya tulis

dengan judul:

“DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f ”

adalah benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri. Apabila kemudian hari ditemukan bahwa skripsi ini menggunakan dan merupakan hasil plagiarisme, maka saya bersedia menerima sanksi berupa pembatalan kelulusan atau pencabutan gelar yang saya peroleh.

Demikian surat pernyataan ini saya buat untuk dipergunakan dengan semestinya.

Surabaya, 28 September 2012

Wildan Alfian Noor NIM: 050810231

iv

Lembar Pengesahan

DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f SKRIPSI

Dibuat Untuk Memenuhi Syarat Mencapai Gelar Sarjana Farmasi Pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

Oleh : WILDAN ALFIAN NOOR NIM. 050810231

Skripsi ini telah disetujui tanggal 4 September 2012 oleh :

Pembimbing Utama Pembimbing Serta

Prof. Dr. Bambang Prajogo EW., MS., Apt. Dr. Suharjono, MS., Apt. NIP. 195612171985031004 NIP. 195212221982031001

KATA PENGANTAR

“Bacalah dengan (menyebut) nama Tuhanmu Yang menciptakan, Dia telah menciptakan manusia dari segumpal darah. Bacalah, dan Tuhanmulah Yang Maha Pemurah, Yang mengajar (manusia) dengan perantaran kalam, Dia mengajar kepada manusia apa yang tidak diketahuinya” (QS Al-alaq 1-5). Alhamdullillah, atas perkenan Allah SWT akhirnya saya bisa mnyelesaikan skripsi yang berjudul “DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f ” dengan sebaik-baiknya. Sholawat serta salam tidak henti-hentinya saya ucapkan kepada Rasulullah Muhammad SAW yang menjadi suri tauladan kebaikan yang langkah hidupnya menginspirasi kita semua.

Saya ucapkan terimakasih yang sedalam-dalamnya atas berbagai pihak yang membantu, menyemangati dan memudahkan selama pengerjaan penelitian ini terutama kepada:

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya Dr. Umi Athijah.,MS.,Apt.

2. Prof. Dr. Bambang Prajogo EW., MS.,Apt sebagai dosen pembimbing utama serta kesempatan yang diberikan kepada saya untuk berpartisipasi dalam tim gendarussa 2012 ini.

3. Dr. Suharjono.,MS.,Apt selaku dosen pembimbing serta yang dengan sabar memberikan masukan dan saran disaat saya

mengalami hambatan penelitian ini.

4. Dr.rer.nat. Mulja Hadi Santosa.,Apt da Prof. Dr. Mangestuti Agil.,MS.,Apt selaku dosen penguji yang telah memberikan

masukan berharga bagi skripsi saya.

5. Bapak Sriyatno.,S.Pd dan Ibu Nihayatul Mahmudah merupakan kedua orang tua saya yang selalu menyemangati dan mendoakan

saya dari rumah.

6. Teman-teman tim gandarusa 2012 yang bersedia membantu saya dalam menyelesaikan penelitian Dica Ryan, Bagus Ovi P, Bayu

vi

Herdi A, Desi Firma, Rosalina KD, Cesario G, Gibrilia A, Dewi Septiananingrum, dan Reza Prajogi. Terimakasih banyak atas segala bantuannya.

7. Rekan-rekan seangkatan PPSDMS Nurul Fikri Surabaya yang selalu menyemangati saya dalam menyelesaikan skripsi ini.

8. Teman-teman anggota kontrakan lukim, kanzul, rozikin, zaki, muslih, dan juga Asset At-taqwa.

9. Teman-teman angkatan 2008 yang paling kompak.

10. Pihak-pihak institusi dari PT Angler Biochemlab yaitu Bapak Suwidji dan Ibu Veronika, laboran lab. MM Bapak Kusairi dan

Mas Iwan, KSKR FK UNAIR dr. Dian Pramesti, dan PT Aneka Gas. Trimakasih atas semua kerjasamanya.

Akhir kata semoga Allah SWT membalas kebaikan pihak-pihak yang membantu kelancaran pengerjaan skripsi ini dengan balasan yang setimpal. Amin.

Surabaya, September 2012

Penulis

vii

RINGKASAN

DETEKSI GENDARUSIN A DALAM URIN SUBYEK PRIA SETELAH PEMBERIAN ORAL KAPSUL EKSTRAK ETANOL DAUN Justicia gendarussa Burm. f

Wildan Alfian Noor

Hasil penelitian menunjukkan bahwa dalam fraksi n-butanol daun gandarusa terdapat 12 komponen flavonoid dengan komponen mayor 6,8- di- α-L-arabinopiranosil-4’,5,7-trihidroksiflavon

atau 6,8-diarabinosil- apigenin, yang kemudian dikenal dengan gendarusin A, salah satu bahan anti fertilitas dengan aktivitas pencegahan penetrasi spermatozoa in vitro dengan mekanisme penghambatan enzim hialuronidase. Komponen minor adalah 6,8- α-L-arabinopiranosil-4’,5,7-trihidroksi-8-β-D-silopiranosilflavon atau 6-arabinosil-8-silosilapigenin yang kemudian dikenal dengan gendarusin B (Prajogo, 2002).

Penelitian tentang penetapan parameter farmakokinetika gendarusin A dalam urin menggunakan 6 subyek pria dengan metode analisis memakai HPLC (Sihabuddin, 2009) serta tentang deteksi gendarusin A dalam urin pada pria hari ke 72 menggunakan HPLC (Saifullah, 2010), kedua penelitian tersebut secara kuantitatif dapat mendeteksi gendarusin A dalam urin sampel. Dasar dari penelitian tersebut adalah kesamaan waktu retensi antara gendarusin A dalam sampel dengan standar gendarusin A. Hal tersebut menjadi dasar untuk melakukan penelitian lebih lanjut yaitu tentang identifikasi gendarusin A dalam urin dengan metode LC-MS/MS untuk memastikan apakah gendarusin A memang terekskresi dalam urin dalam bentuk utuh. LC-MS/MS memiliki kemampuan yang terpercaya untuk mengidentifikasi gendarusin A dalam sampel urin karena dapat menampilkan data tiga dimensi yaitu sebagai fungsi sinyal terhadap waktu serta spektrum masa dari analit yang akan diidentifikasi.

Dari 4 subyek , masing-masing diberikan kapsul gandarusa dengan dosis 900 mg ekstrak (setara dengan 3,78 mg gendarusin A) daun Justicia

viii viii

C, kecepatan alir 1 ml/menit, dan detektor DAD UV/Vis. Fase gerak yang digunakan adalah sistem gradien metanol/air dengan waktu analisis 11 menit. Selektivitas yang diperoleh dari analisis gendarusin A dalam blanko urin diperoleh resolusi 2,12 dan faktor selektivitas 1,58.

Selanjutnya digunakan alat LC-MS/MS yang mempunyai sensitivitas lebih tinggi daripada HPLC dengan menggunakan kolom eclipse plus C-18 4,6 x 50 mm 3,5 um, kecepatan alir 1 ml/menit temperatur kolom

C, polaritas negatif dan tipe skanning MRM (Multiple Reaction Monitoring). Dilakukan optimasi awal berupa tuning yaitu dengan infusi standar ke dalam MS (Mass Spectrometer) dengan hasil m/z apigenin [M- H] - 269 Da dan gendarusin A [M-H] - 533 Da. MRM terpilih untuk apigenin adalah m/z 268,9/116,8 Da dan m/z 268,9/150,8 Da. MRM terpilih untuk gendarusin A adalah m/z 533/352,9 Da dan m/z 533/382,9 Da. Kromatografi awal dari standar gendarusin A menunjukkan puncak kecil yang muncul yang kemungkinan berasal dari isomer yang masih terikutkan dalam standar gendarusin A. LOD (Limit of Detection) sebesar 1,179 ppb dan LOQ (Limit of Quantification) sebesar 2,009 ppb dari gendarusin A dengan LC-MS/MS.

50 o

Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 4 subyek dengan sampel akumulasi urin 24 jam hanya ditemukan 1 subyek terdeteksi gendarusin A dengan intensitas maksimal 100,0 cps. Hasil analisis sampel urin pada poin- poin waktu pengumpulan tidak menunjukkan deteksi gendarusin A maupun apigenin di dalam urin. Hal tersebut bisa terjadi karena perbedaan konsentrasi gendarusin A dalam urin subyek karena total volume urin yang berbeda atau terjadi metabolisme gendarusin A yang terkonjugasi dengan molekul endogen tubuh seperti sulfat atau glukoronat.

ix

ABSTRACT

Detection C-glycosyl flavonoid, 6,8-diarabinosilapigenin, In Urine Male Subject after Oral Ingestion Capsules Ethanol Extract Leaf Justicia gendarussa Burm. f

Wildan Alfian Noor

Justicia gendarussa Burm. f has 12 flavonoid component with major component 6.8-di- α-L-arabinopiranosil-4',5,7-trihidroksiflavon or 6,8-diarabinosilapigenin, which have been known as gendarusin A, one of the anti-fertilities with prevention activities penetration of spermatozoa in vitro with hyaluronidase enzyme inhibition mechanism.

The purpose of this study is to detect of intact C-glycosyl flavonoid, 6,8-diarabinosilapigenin in human urine after oral ingestion capsules from ethanol extract leaves Justicia gendarussa Burm. f. Four healhty subjects, each one given a dosage gandarusa extract 900 mg equal

3.78 mg of gendarusin A from leaves Justicia gendarussa Burm F (2 capsules). For chromatography used HPLC (preliminary study) with Novapak column Waters C-

18 3.9 X 150 mm 60 Å, 4 μm, column temperature of 30 o

C, flow rate of 1 ml / min, and DAD detector UV/Vis. The mobile phase used was a gradient system of methanol / water. Selectivity obtained from the analysis of the blank urine spiked with 6,8- diarabinosilapigenin , resolution 2,12 and selectivity factor 1,58.

The study continued with LC-MS/MS QTRAP using column eclipse plus C-18 4.6 x 50 mm 3.5 um, flow rate 1 ml / min, temperature column 50° C, negative mode and scan type MRM (Multiple Reaction Monitoring). Perform an initial optimization by tuning the standard infusion into the MS (Mass Spectrometer) show apigenin with m/z [M-H] - 269 Da and gendarusin A m/z [M-H] - 533 Da. Chromatography of standard gendarusin A shows a small peak appears, indicating the possibility that it came from isomer from the analyte. LOD 1.179 ppb and LOQ 2.009 ppb from gendarusin A. From 4 subjects with accumulation of 24-hour urine samples found only 1 subject with identification gendarusin A in the form intact with a maximum intensity of 100.0 cps. Urine samples at collection time points showed no detection both gendarusin A and apigenin.

Keyword: Justicia gendarussa Burm. f, HPLC, LC-MS/MS, C-glycosyl flavonoid, gendarusin A, urine

46

4.7 Penentuan kond isi HPLC (pendahuluan)………….

46

4.7.1 Pemiliha n panjang gelombang………………

46

4.7.2 Opti masi fase gerak…………………………..

47

4.8 Optimasi metode (pendahul uan)…………………...

47

4.8.1 Optimasi sta ndar gendarusin A dan apigenin…

48

4.8.2 Optimasi serapan standard dan blanko urin…

48

4.8 .3 Uji selektivitas………………………………..

49

4.8.4 Penentuan perolehan kembal i………………..

49

4.9 Penentuan kondisi LC- MS/MS…………………….

49

4.9.1 Optimasi k ondisi kromatografi………………

50

4.9.2 Fase gerak…………………………………….

50

4.9.3 Opt imasi kondisi MS…………………………

50

4.9.4 Penentuan LOD/LOQ…………………………

51

4.10 Pre parasi sampel………………………………….

51 BAB V HASIL PENELITIAN

4.11 Pengolahan data…………………………………..

5.1 Pemilihan kondisi HPLC…………………………… 53

53

5.1.1 Hasil pemilihan panjang gelombang………….

54

5.1.2 Hasil pemilihan fase gerak……………………

56

5.2 Hasil pe milihan metode preparasi urin…………….

57

5.3 Hasil optim asi metode kualitatif……………………

5 .3.1 Selektivitas……………………………………. 57

59

5. 3.2 Persen rekoveri……………………………….

5.4 Hasil optimasi menggunakan LC-MS/MS QTRAP 4000 series …………………...

60

60

5.4.1 Hasil tuning awal……………………………..

62

5.4.2 Hasil pemilihan fase gerak LC- MS/MS………

64

5.4.3 Perhitungan LOD/LOQ………………………

65

5.4.4 Efek matriks………………………………….

66

5.5 Identifikasi metabolit A dalam urin………………..

68 BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN

B AB VI PEMBAHASAN……………………………………..

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Fase gerak yang digunakan …………………….…

47 Tabel 5.1 Fase gerak HPLC gendarusin A …………………..

54 Tabel 5.2 Rekoveri standar gendarusin A

59 Tabel 5.3. Fase gerak sistem gradien LC-MS/MS ……………

dalam urin blanko ………………………………….

62 Tabel 5.4. Perhitungan LOD dan LOQ ……………………….

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Tanaman Justicia gendarussa Burm. f....................

7 Gambar 2.2 Struktur Alkaloid Justicia gendarussa Burm. f...

9 Gambar 2.3 Struktur dasar flavonoid ........................................

14 Gambar 2.4 Sistem penomoran untuk turunan flavonoid..........

14 Gambar 2.5 Beberapa aglikon flavonoid...................................

15 Gambar 2.6 Struktur molekul gandarusin A …………………

18 Gambar 2.7 Struktur molekul gandarusin B..............................

18 Gambar 2.8 Skema bioavaibilitas, absorbsi, distribusi, metabolisme dan eksresi dari flavonoid ………...

21 Gambar 2.9 Contoh kromatogram MRM LC-MS/MS dari 3-O-MA dan 4-O-MA ………………………

25 Gambar 2.10 Contoh kromatogram LC-ESI-MS/MS dari sampel urin setelah konsumsi ekstrak rooibos …..

26 Gambar 2.11 Penerapan berberapa teknik ionisasi LC/MS ……

32 Gambar 2.12 MS/MS dengan spektrometer massa triple-quadrupole …………………………

34 Gambar 3.1 Skema kerangka konseptual ………………………

40 Gambar 3.2 Skema kerangka operasional ……………………..

41 Gambar 5.1 Spektra 2D gendarusin A yang menunjukkan panjang gelombang maksimum pada 340 nm …...

53 Gambar 5.2 Kromatogram HPLC standar gendarusin A

32 ppm pada berbagai panjang gelombang ………

xvi

Gambar 5.3 Kromatogram HPLC gendarusin A 32 ppm dalam berbagai komposisi fase gerak …………….

55 Gambar 5.4 Skema ekstraksi gendarusin A pada sampel urin....

57 Gambar 5.5 Kromatogram HPLC, blanko urin, gendarusin A /metanol, gendarusin A dalam urin blanko …. .

58 Gambar 5.6 Profil LC-MS/MS standar apigenin CE 40………..

60 Gambar 5.7 Profil LC-MS/MS standar gendarusin A CE 100 dan CE 50 ……………………………….

61 Gambar 5.8 Kromatogram LC-MS/MS standar apigenin ….

62 Gambar 5.9 Kromatogram LC-MS/MS standar gendarusin A.

63 Gambar 5.10 Kromatogram LC-MS/MS pre / post spike standar gendarusin A dalam urin blanko …………

65 Gambar 5.11 Kromatogram LC-MS/MS identifikasi gendarusin A dalam urin subyek AST dan BAG..

66 Gambar 5.12 Kromatogram LC-MS/MS identifikasi gendarusin A dalam BAY dan DYC ……………..

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Ket erangan Kelaikan Etik………………………….

83 Lampiran 2 Naskah Penjelasan Untuk Mendapatkan Persetujuan

84 Sukarelawan dan Formulir Persetujuan (Inform Consent) Lampiran 3 De claration Helsinki………………………………..

89 Lampiran 4 K arakteristik Subyek………………………………..

93 Lampiran 5 Kromatogram LC- MS/MS LOD dan LOQ……..….

94 Lampiran 6 Kromatogram sampel LC-MS/MS QTRAP 4000 Series ……………………………….

97 Lampiran 7 Formula kapsul Ekstrak Etanol Daun J. gendarussa Burm. f …………………….

xviii

DAFTAR SINGKATAN

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization APPI

Atmospheric Pressure Photoionization

As Arsen CBG

Cytosolic Β Glucosidase Cd Cadmium

CE Collision Energy CID

Collision-Induced Dissociation COMT

Catechol-O-Methyltransferases CPE

Corona Penetration Enzyme CSP

Chiral Stationary Phase Da Dalton

DAD Diode Array Detektor ESI

Electrospray Ionization FT-ICR

Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance GC-MS

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Hg Hydrargyrum

HPLC High Performance Liquid Chromatography IVF

In Vitro KB

Keluarga Berencana KSKR

Kelompok Studi Kesehatan Reproduksi LC

Liquid Chromatography LC-MS/MS

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry LD50

Lethal Dose 50

xix

LOD Limit Of Detection LOQ

Limit Of Quantification LPH

Lactase Phloridizin Hydrolase MRM

Multiple Reaction Monitoring MRP

Multidrug Resistance Protein MS

Mass Spectrometry ODS

Octadecyl-Silica Pb

Plumbum P-gp

P-Glycoprotein ppb

part per billion ppm

part per million QTRAP

Quadrupole Ion Trap RP-HPLC

Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography Rs

Resolution SD

Standart Deviation SULT

Sulfotransferases TIC

Total Ion Current tR

Retention time UGTs

Uridine- 5’-Diphosphatase Glucoronosyl-Transferases UV

Ultra Violet UV-Vis

Ultraviolet-Visible VOG

vitexin- 4”-O-glucoside VOR

vitexin- 4”-O-rhamnoside

xx

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Daun Justicia gendarusa Burm. f. diketahui mengandung kalium, flavonoid, steroid atau triterpenoid, tannin 0,4% (DepKes RI,1995); alkaloid, amin aromatik, iridoid dan kumarin (Prajogo, 2002). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dalam fraksi n-butanol daun gandarusa terdapat 12 komponen flavonoid dengan komponen mayor 6,8-di- α-L- arabinopiranosil-4 ’,5,7-trihidroksiflavon atau 6,8-diarabinosilapigenin, yang kemudian dikenal dengan gendarusin A, salah satu bahan antifertilitas dengan aktivitas pencegahan penetrasi spermatozoa in vitro dengan mekanisme penghambatan enzim hialuronidase. Komponen minor adalah 6,8- α-L-arabinopiranosil-4’,5,7-trihidroksi-8-β-D-silopiranosilflavon atau 6- arabinosil-8-silosilapigenin yang kemudian dikenal dengan gendarusin B (Prajogo, 2002). Dari hasil studi bioaktivitas dari ekstrak diklorometana dan methanol, daun Justicia gendarusa Burm. f dapat menurunkan motilitas dan viabilitas spermatozoa kelinci, mencit dan manusia secara in vitro dan menghambat spermatogenesis mencit. Fraksi etil asetat dan n-butanol daun Justicia gendarusa Burm. f dapat menghambat motilitas dan viabilitas spermatozoa secara in vitro, serta pemberian infus dapat menurunkan kadar testosteron serum tikus (Prajogo, 2002).

Penelitian tentang Justicia gendarusa Burm. f sudah dilakukan sejak tahun 1987 mengenai aktivitas anti fertilitasnya pada pria secara farmakologis dan analisis fitokimia. Untuk dapat dikonsumsi oleh manusia Penelitian tentang Justicia gendarusa Burm. f sudah dilakukan sejak tahun 1987 mengenai aktivitas anti fertilitasnya pada pria secara farmakologis dan analisis fitokimia. Untuk dapat dikonsumsi oleh manusia

Penelitian ini dilakukan untuk mendeteksi senyawa gendarusin A yang telah melewati berbagai kompartmen dalam tubuh manusia yang terekskresi di dalam urin subyek pria setelah pemberian ekstrak etanol daun Justicia gendarusa Burm. f. Studi juga dapat dipergunakan untuk mengidentifikasi hasil metabolit dari senyawa gendarusin A dalam urin dan sebagai langkah awal untuk menjelaskan proses biotransformasi dalam tubuh manusia dari senyawa gendarusin A yang mempunyai khasiat sebagai antifertilitas bagi pria.

Dari hasil penelitian sebelumnya yang juga menggunakan sampel urin tentang penetapan parameter farmakokinetika gendarusin A dalam urin menggunakan 6 subyek pria dengan metode analisis memakai HPLC (Sihabuddin, 2009) serta penelitian tentang deteksi gendarusin A dalam urin pada pria hari ke 72 menggunakan HPLC (Saifullah, 2010) secara kuantitatif dapat mendeteksi metabolit dalam urin manusia yang mempunyai waktu retensi sama dengan standar gendarusin A. Hal ini menimbulkan pertanyaan apakah gendarusin A terekskresi dalam bentuk utuh di dalam urin manusia.

Obat yang masuk ke dalam tubuh umumnya akan mengalami proses absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi. Sehingga obat akan

mengalami perubahan bentuk (biotransformasi) menjadi bentuk metabolit dan terkonjugasi dengan molekul-molekul yang berada di dalam tubuh menjadi bentuk yang lebih polar agar dapat dieliminasi dari tubuh. Studi ilmiah tentang biotransformasi, proses absorbsi, metabolisme dan bioavaibilitas secara in vivo dari senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol daun Justicia gendarusa Burm. f masih belum secara jelas diketahui dan dilakukan. Secara umum dapat diterima bahwa bentuk glikosida dari flavonoid yang terkandung dalam makanan saat dikonsumsi akan terhidrolisis menjadi bentuk free aglycons yang selanjutnya akan berubah menjadi bentuk terkonjugasi dengan sulfat dan glukoronat oleh liver dan permukaan epitel yang lain. Konjugat biologi ini akan mengalami sirkulasi bersama plasma dan terekskresi bersama urin dan feses (Clarke et al., 2002). Sehingga perlu adanya penelitian tentang deteksi gendarusin A dalam urin manusia untuk memastikan apakah gendarusin A memang terekskresi dalam bentuk utuh di urin atau terkonjugasi dengan senyawa endogen tubuh.

Gendarusin A merupakan jenis di-C-glycosyl flavonoid yang merupakan senyawa baru yang masih sedikit diketahui bioavaibilitasnya pada manusia karena belum adanya informasi yang lengkap tentang mekanisme absorbsi dari C-glycosyl flavonoid pada tubuh manusia. Namun terdapat bukti dari penelitian tentang C-glycosyl flavonoid aspalathin yang terabsorbsi dalam bentuk utuh pada manusia tanpa proses deglikosilasi, serta termetilasi dan terglukoronidasi dalam bentuk utuh pada urin manusia (Courts and Williamson, 2009). Berdasarkan hal tersebut kemungkinan Gendarusin A merupakan jenis di-C-glycosyl flavonoid yang merupakan senyawa baru yang masih sedikit diketahui bioavaibilitasnya pada manusia karena belum adanya informasi yang lengkap tentang mekanisme absorbsi dari C-glycosyl flavonoid pada tubuh manusia. Namun terdapat bukti dari penelitian tentang C-glycosyl flavonoid aspalathin yang terabsorbsi dalam bentuk utuh pada manusia tanpa proses deglikosilasi, serta termetilasi dan terglukoronidasi dalam bentuk utuh pada urin manusia (Courts and Williamson, 2009). Berdasarkan hal tersebut kemungkinan

Ada tiga pendekatan utama untuk mengetahui informasi tentang konjugasi. Pertama adalah untuk melakukan hidrolisis enzimatik secara selektif untuk menghasilkan data dari total sulfat, total glukoronat dan free aglycons, serta menentukan jumlah semua senyawa yang sebenarnya sebagai konsentrasi aglikon. Kedua adalah memisahkan konjugat menjadi fraksi-fraksi dengan langkah-langkah proses kromatografi, melakukan hidrolisis dari fraksi yang terpisah tersebut, dan menentukan jumlah aglikon yang dihasilkan, biasanya menggunakan GC-MS. Ketiga, hal yang mungkin dilakukan adalah dengan mengukur langsung jumlah semua konjugat secara bersamaan, tanpa langkah pengolahan sampel dimana rasio konsentrasi dari konjugat dan aglikon dapat terpengaruh. (Clarke, et al., 2002).

Berdasarkan uraian diatas teknik analisis saat ini yang memenuhi kualifikasi dan kuantifikasi penuh dari deteksi analit dalam matriks biologi adalah LC-MS/MS. Penggunaan mass spectrometry untuk penelitian sejenis telah dilakukan yaitu tentang penentuan jumlah isoflavon glukoronat dalam urin tikus dengan LC-ESI/MS dan ion-trap LC-MS/MS (Doerge et al., 2000; Fang et al., 2002), isoflavon glukoronat dan sulfat dari darah manusia (Needs, G et al., 2001), dan deteksi metabolit genistein sulfat dengan LC- ESI-MS/MS. Faktor pembatas yang mempengaruhi penelitian-penelitian tersebut adalah kurangnya standar konjugat yang cocok untuk identifikasi dan kuantifikasi. Dengan standar tertentu, aglikon isoflavon maupun konjugasinya dapat diukur secara langsung.

. Metode LC-MS/MS merupakan gabungan dari dua teknik analisis yaitu liquid chromatography dan mass spectrometers. Liquid chromatography (LC) adalah teknik pemisahan yang fundamental di dalam ilmu science dan terkait dengan kimia. Tidak seperti gas kromatografi, yang tidak dapat digunakan untuk molekul-molekul yang tidak dapat menguap dan tidak stabil terhadap panas. Liquid chromatography (LC) dapat memisahkan banyak komponen organik secara aman, seperti metabolit dari obat dengan molekul yang kecil sampai peptida dan protein. Mass spectrometers (MS) juga dapat menampilkan data secara tiga dimensi. Dengan penambahan kekuatan sinyal juga dapat menampilkan data yang penting seperti berat molekul, struktur molekul, kuantitas dan kemurnian dari sampel. Data dari mass spectra dapat menambah spesifitas yang meningkatkan hasil analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Metode LC- MS/MS tersebut dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa gendarusin A dan mengembangkan penelitian sejenis tentang penentuan metabolit dari gendarusin A dalam urin manusia serta senyawa lain yang terkandung di dalam ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm F.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang tersebut, maka dapat diambil suatu permasalahan sebagai berikut:

Apakah gendarusin A ditemukan dalam urin subyek pria setelah pemberian kapsul ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm. f ?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendeteksi gendarusin A dalam urin dan menunjang penelitian-penelitian yang lain dalam proses pengembangan Justicia gendarusa Burm. f sebagai kandidat obat kontrasepsi herbal baru bagi pria.

Sedangkan tujuan khusus dari penelitian ini adalah mendeteksi gendarusin A dalam urin subyek pria setelah pemberian kapsul ekstrak etanol daun Justicia gendarusa Burm. f dengan menggunakan metode LC- MS/MS.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk:

1. Mendeteksi gendarusin A dalam urin subyek pria setelah pemberian ekstrak etanol daun Justicia gendarusa Burm. f dengan

menggunakan LC-MS/MS sebagai bentuk yang tidak berubah.

2. Menambah informasi dan menunjang penelitian-penelitian yang lain dalam proses pengembangan Justicia gendarusa Burm. f

sebagai kandidat obat kontrasepsi herbal baru bagi pria.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan tentang Justicia gendarussa Burm. f.

Gambar 2.1 Tanaman Justicia gendarussa Burm. f.

2.1.1 Klasifikasi

Klasifikasi (Van Steenis, 1978) Divisi

: Spermatophyta Anak Divisi

: Angiospermae Kelas

: Dicotyledonae Anak Kelas

: Sympetalae Bangsa

: Schropulariales Suku

: Achanthaceae Marga

: Justicia Jenis

: Justicia gendarussa Burm.f. Sinonim

: Gendarussa vulgaris Nees Justicia dahona (Buch) Justicia nigricans Lair Justicia salicina Vahl

2.1.2 Nama Daerah

Aceh : besi-besi Jawa : gandarusa, handarusa, ghandharusa Bima : gandarisa Ternate : puli (DepKes RI, 1995)

2.1.3 Morfologi Tanaman Justicia gendarussa Burm F merupakan tanaman perdu yang

tumbuh tegak di hutan atau ditanam sebagai tumbuhan obat atau tanaman pagar. Tanaman ini di Jawa ditemukan tumbuh pada ketinggian 1-500 m dpl. Morfologi lain dari tanaman ini adalah batang yang berkayu, bentuknya segiempat tumpul atau cukup bulat, warnanya ungu (muda) dan coklat muda (tua), tinggi 0,7-2 m, bercabang. Daun tunggal bertangkai pendek (5-8 mm), letak berhadapan, helai daun berbentuk lanset, berlekuk lebar dan tidak dalam, ujung meruncing, pangkal berbentuk baji, pertulangan menyirip, panjang 5-20 cm, lebar 1-3,5 cm, warna hijau tua. Bunga majemuk, tersusun dalam malai, keluar dari ketiak daun atau ujung percabangan, mahkota berbentuk tabung, berbibir dua, putih. Daun pelindung kecil, sempit, runcing dan hampir sama. Buah berbentuk, bulat panjang, berbiji empat, licin. (Dalimartha, 1999 dan Steenis, 1997)

2.1.4 Kandungan Kimia Tanaman

Kalium, flavonoid, steroid/triterpenoid, tannin 0,4 %, minyak atsiri, kalsium oksalat, dan alkaloid (MMI, 1995 dan Dalimartha, 1999). Dari hasil penelitian diketahui bahwa dalam fraksi n-butanol gandarusa terdapat 12 komponen flavonoid dengan berat molekul sama. Komponen mayor Kalium, flavonoid, steroid/triterpenoid, tannin 0,4 %, minyak atsiri, kalsium oksalat, dan alkaloid (MMI, 1995 dan Dalimartha, 1999). Dari hasil penelitian diketahui bahwa dalam fraksi n-butanol gandarusa terdapat 12 komponen flavonoid dengan berat molekul sama. Komponen mayor

Kandungan alkaloid yang telah diisolasi dari daun Justicia gendarussa Burm. f. antara lain 2-amino benzil alkohol, 2-amino-O-metil benzil alkohol, 2- (2’-amino-benzilamino) benzil alkohol, serta 2-(2’-amino- benzil)-O-metil-benzil alkohol (Chakravarty & Dastidar, 1982).

H 2 C OH

CH H 2 N 2 OCH 3

H 2 C 2-amino benzil alkohol

NH 2 NH

2- (2’-amino-benzylamino)- O- metil-benzil alkohol

2- (2’-amino-benzilamino) 2-amino-O-metil-benzil alkohol benzil alkohol

Gambar 2.2 Struktur Alkaloid Justicia gendarussa Burm. f. (Chakravarty,

et al.,1981).

2.1.5 Kegunaan Tanaman

Daun tanaman Justicia gendarussa Burm. f. pada umumnya digunakan sebagai obat penawar racun. Dalam bentuk ramuan tradisional, daun-daun ditumbuk bersama cuka dan merica digunakan untuk sakit kepala Daun tanaman Justicia gendarussa Burm. f. pada umumnya digunakan sebagai obat penawar racun. Dalam bentuk ramuan tradisional, daun-daun ditumbuk bersama cuka dan merica digunakan untuk sakit kepala

Bagi orang Melayu, daun gandarusa terkenal sebagai obat encok dan sakit pinggang, daun yang ditumbuk bersama merica putih digunakan sebagai obat yang memperlancar datang bulan. Air rebusan daun gandarusa dapat mengeluarkan keringat dan mencegah demam. Di Sulawesi daunnya digunakan seb.agai obat cuci perut. (Heyne, 1987).

Di Irian Jaya, daun dan akar direbus dan diminum setidaknya 2 kali sebulan bagi suami untuk kontrasepsi atau KB. (Moeso dan Agus, 1985).

2.1.6 Bioaktivitas daun Justicia gendarusa Burm. f

Pada proses fertilisasi secara biokimia diketahui diperlukan adanya enzim akrosin, hialorunidase dan enzim penetrasi korona (CPE). Enzim- enzim tersebut berada pada membran akrosom dari bagian kepala spermatozoa. Setiap enzim sangat berperan dalam proses fertilisasi. Enzim penetrasi korona sangat penting dalam penetrasi spermatozoa pada lapisan korona radiata. Hialorunidase akan berinteraksi dengan matriks kumulus ooforus dan selanjutnya enzim akrosin akan bereaksi dengan zona pelusida. Proses penetrasi sperma dan ovum memerlukan enzim hialorunidase yang akan melonggarkan lapisan sel folikuler. Gangguan pada kualitas dan kuantitas enzim hialorunidase akan menyebabkan gangguan pada kemampuan spermatozoa melakukan fertilisasi. Ekstrak diklormetan memberikan efek hambatan pada fungsi spermatozoa mencit dalam proses Pada proses fertilisasi secara biokimia diketahui diperlukan adanya enzim akrosin, hialorunidase dan enzim penetrasi korona (CPE). Enzim- enzim tersebut berada pada membran akrosom dari bagian kepala spermatozoa. Setiap enzim sangat berperan dalam proses fertilisasi. Enzim penetrasi korona sangat penting dalam penetrasi spermatozoa pada lapisan korona radiata. Hialorunidase akan berinteraksi dengan matriks kumulus ooforus dan selanjutnya enzim akrosin akan bereaksi dengan zona pelusida. Proses penetrasi sperma dan ovum memerlukan enzim hialorunidase yang akan melonggarkan lapisan sel folikuler. Gangguan pada kualitas dan kuantitas enzim hialorunidase akan menyebabkan gangguan pada kemampuan spermatozoa melakukan fertilisasi. Ekstrak diklormetan memberikan efek hambatan pada fungsi spermatozoa mencit dalam proses

glukosidase kelinci dan secara kualitatif menyebabkan sifat inhibitor hialorunidase pada testis sapi (Prajogo dkk, 1998b).

Pemberian fraksi air daun gendarusa pada mencit jantan dengan dosis per oral 26.06 mg/ 20 g BB; 18,39 mg/ 20 g BB; 3,47 mg/ 20 g BB dan 3,13 mg/ 20 g BB atau 1/12, 1/17, 1/90 dan 1/100 LD 50 satu kali sehari selama 1,5 kali siklus spermatogenesis menyebabkan hambatan aktivitas enzim hialorunidase pada kumulus ooforus sehingga terjadi hambatan penetrasi spermatozoa pada mencit (Arif, 2005).

Uji toksisitas akut (LD 50 ) dan uji teratogenik ekstrak etanol 60 % daun gendarusa dengan dosis 17,83 g/kg BB, dan fraksi air bebas alkaloid dengan dosis 15,63 g/kg BB pada mencit galur Balb C, termasuk kategori praktis tidak toksik dan tidak menyebabkan efek teratogen (Prajogo dkk, 2008).

2.1.7 Standarisasi ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm. f.

Penentuan parameter standar umum ekstrak etanol 70 % daun Justicia gendarussa telah dilakukan. Hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut: -Kadar sari larut air

: 22,36 % + 0,76 -Kadar sari larut etanol

: 12,54 % + 0,82 -Susut pengeringan

: 25,85 % + 0,07 -Kadar air

: 15,83% + 0,13 -Kadar abu

-Kadar minyak atsiri : 0,59 % + 0,01 -Cemaran logam berat

: Hg = 0,000 mg/kg As = 0,00 mg/kg Pb = 1,673 ppm Cd = 0,184 ppm

Parameter standar umum simplisia daun Justicia gendarusa sama dengan parameter standar umum yang ada di buku Materia Medika Indonesia. Untuk penetapan kadar gendarusin A dalam ekstrak dilakukan menggunakan metode HPLC. Dari penetapan tersebut didapatkan kadar gendarusin A sebesar 0,42 % + 0,01 (Bagus, 2012).

2.2 Tinjauan Tentang Senyawa Flavonoid

Flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam yang terbesar. Flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau dengan mengecualikan alga dan hornwort. Pada tumbuhan tinggi, flavonoid terdapat baik dalam bagian vegetatif maupun bagian dalam bunga. Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah buni dan biji. Flavonoid mencakup banyak pigmen yang paling umum dan terdapat pada seluruh dunia tumbuhan mulai dari fungi sampai angiospermae. Flavonoid sering terdapat sebagai glikosida dan tersebar luas dalam bentuk O-Glikosida. Bentuk glikosida ini ditemukan pada bunga, buah dan daun. Sementara bentuk bebasnya dijumpai pada jaringan kayu (Markham, 1988).

2.2.1 Kegunaan Flavonoid

Sebagai pigmen bunga, flavonoid berperan jelas dalam menarik burung dan serangga penyerbuk bunga. Beberapa flavonoid tanpa warna, tetapi flavonoid yang menyerap sinar UV barangkali penting juga dalam mengarahkan serangga. Banyak peranan lain flavonoid pada tanaman yang mengandungnya, diantaranya adalah pengaturan tumbuh, pengaturan fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus, dan kerja terhadap serangga. Beberapa flavonoid, seperti jenis fitoaleksin lain, merupakan komponen abnormal yang hanya dibentuk sebagai tanggapan terhadap infeksi atau luka dan kemudian menghambat fungus yang menyerangnya. Beberapa flavonoid yang dihasilkan oleh tumbuhan polong meng-imbas gen pembintilan dalam bakteria bintil penghambat nitrogen, sementara flavonoid yang lain membalikkan pengaktifan tersebut (Markham, 1988)

Efek flavonoid terhadap bermacam-macam organisme sangat banyak macamnya dan dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak dipakai dalam pengobatan tradisional (Markham, 1988).

2.2.2 Struktur Dasar Flavonoid

Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid (flavonoid tanpa gula terikat) terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Semuanya mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C 6 -C 3 -C 6 , yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga (Markham, 1988).

Struktur dasar flavonoid

Gambar 2.3 Struktur dasar flavonoid (Markham, 1988). Susunan tersebut dapat menghasilkan tiga jenis struktur, yaitu 1,3-

diarilpropan atau flavonoid, 1,2-diarilpropan atau isoflavon dan 1,3- diarilpropan atau neoflavonoid. Istilah flavonoid dikenal sebagai suatu golongan besar senyawa yang berasal dari kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon (Markham, 1988). Sistem penomoran untuk turunan flavonoid sebagai berikut:

B A 4'

6'

5'

Gambar 2.4 Sistem penomoran untuk turunan flavonoid.

2.2.3 Aglikon Flavonoid

Aglikon flavonoid atau flavonoid bebas, yaitu flavonoid tanpa gula terikat. Ada beberapa jenis aglikon flavonoid yang muncul di alam disebabkan karena perbedaan tingkat oksidasi cara dari flavonoid menutup cincin A. Berikut ada delapan jenis aglikon flavonoid, yaitu flavon, khalkon, flavonol, flavanon, flavan-3-ols, isoflavon, antosianidin, dan flavanonol (Tapas et al, 2008)

Gambar 2.5 Beberapa aglikon flavonoid

2.2.4 Flavonoid O-glikosida

Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid O-glikosida, dimana terdapat satu gugus hidroksil flavonoid atau lebih terikat pada satu gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tidak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoid menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air sehingga memungkinkan penyimpanan flavonoid dalam vakuola. O-glukolasi (dan metilasi) terjadi sebagai salah satu tahap akhir pada proses biosintesis dan dikatalisis oleh enzim yang sangat khas (Markham, 1988).

Glukosa adalah gula yang paling umum terlibat. Galaktosa, ramnosa, xilosa arabinosa sering juga terdapat. Sedangkan gula lain yang kadang- kadang dotemukan adalah alosa, manosa, fruktosa, apiosa, asam glukuronat dan galakturonat (Markham, 1988).

2.2.5 Flavonoid C-glikosida

Gugus gula juga dapat terikat pada atom C flavonoid, yaitu pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam (dibandingkan dengan O-glikosida). Glikosida yang demikian disebut favonoid C- glikosida. Gula yang terikat hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid. Jenis gula yang terlibat jauh lebih sedikit ketimbang jenis gula pada O-glikosida, biasanya dari jenis glukosa, galaktosa, ramnosa, xilosa dan arabinosa (Markham, 1988).

2.2.6 Sifat dan Kelarutan Flavonoid

Aglikon flavonoid adalah polifenol, oleh karena itu mempunyai sifat seperti fenol, yaitu agak asam. Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil, sehingga dapat larut pada pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain-lain. Sedangkan aglikon seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol yang termetilasi bersifat kurang polar sehingga cenderung lebih mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).

2.3 Tinjauan tentang Gendarusin A

Gendarusin A merupakan komponen mayor yang terkandung dalam tanaman Justicia gendarussa Burm. f. Nama lain dari gendarusin A adalah 6,8-di- α-L-arabinopiranosil-4’,5,7 trihidroksiflavon atau 6,8- diarabinosilapigenin yang mana senyawa tersebut digolongkan dalam kelompok di-C-glycosyl flavonoids (Markham & andersen, 2006). Selain senyawa tersebut, dalam tanaman Justicia gendarussa Burm. f. Juga terdapat komponen minor yang salah satunya adalah 6- α-l-arabinopiranosil- 4’,5,7-trihidroksi-8-β-D-silopiranosilflavon

atau 6-arabinosil-8 – silosilapigenin yang kemudian dikenal dengan gendarusin B (Prajogo, 2002).

Hasil isolasi dan purifikasi gendarusin A dari tanaman Justicia gendarussa Burm. f. yang telah dilakukan menunjukkan bahwa gendarusin

A memiliki berat molekul sebesar 535. Pada prosesnya dilakukan analisis dari senyawa mayor 40 mg dengan menggunakan 1H-13C NMR, Varian Unity INOVA 500 MHZ.

Gendarusin A mengandung inti aglikon flavon yakni apigenin yang mengikat dua gugus gula pada ikatan C flavonoid, yaitu pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam pada atom C nomor 6 dan 8 (Markham, 1988).

Gambar 2.6 Struktur molekul 6,8-di- α-L-arabinopiranosil-4’,5,7- trihidroksi-flavon atau 6,8-diarabinosil-apigenin dikenal sebagai gandarusin

A (Prajogo, 2002)

Gambar 2.7 Struktur molekul 6- α-L-arabinopiranosil-4’,5,7-trihidroksi-8- β-D-silopiranosilflavon atau 6-arabinosil-8-silosilapigenin dikenal dengan

gandarusin B (Prajogo, 2002).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan diketahui bahwa gendarusin A mempunyai aktivitas pencegahan penetrasi spermatozoa in vitro. Hal tersebut ditunjukkan dari hasil uji aktivitas in vitro gendarusin A dengan metode IVF. Hasil uji fertilisasi in vitro (IVF) dari komponen major flavonoid murni (gendarusin A) J.gendarussa pada spermatozoa epididimis mencit in vitro menunjukkan hasil yang positif, yakni tidak terjadinya fertilisasi selama 5 jam inkubasi (Prajogo, 2002).

2.4 Penelitian sebelumnya tentang Gendarusin A dalam Urin

Penelitian tentang gendarusin A dalam urin sudah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan alat HPLC dengan tujuan untuk dikuantifikasi menggunakan validasi metode yang terpilih. Penelitian pertama dilakukan oleh Sihabuddin pada tahun 2009 tentang penetapan parameter farmakokinetika gendarusin A dalam urin subyek pria setelah pemberian sediaan ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm F. Penelitian tersebut menggunakan 1% ekstrak dalam 100 ml suspensi mengandung 16,4 mg gendarusin A, diberikan secara peroral pada enam subyek (n=6) pria sehat. Data farmakokinetikanya diperoleh dari penampungan urin dalam interval waktu selama 24 jam. Penentuan kadar urin dengan menggunakan metode HPLC menggunakan kolom Waters Novapak C-18, fase gerak sistim gradien (metanol:asam fosfat 0,2%), kecepatan alir 1,0 ml/menit, suhu 30 o

C, panjang gelombang 270 nm. Waktu retensi stándar gendarusin A sekitar 7,8 menit, LOD 0,0817 ug/ml, dan LOQ 0,2724 ug/ml. Hasil yang diperoleh adalah tetapan laju eliminasi (K el ) 0,08-0,28 jam -1 (rata-rata 0,18 + 0,07 jam -1 ) dan waktu paruh eliminasi (t 1/2 ) 2,44-8,53 jam (rata-rata 4,44 + 2,14 jam).

Penelitan kedua dilakukan oleh Saifullah tahun 2010 tentang deteksi gendarusin A dalam urin pria fértil pada hari ke-144 setelah pemberian kapsul ekstrak etanol 70% daun Justicia gendarussa Burm F selama 72 hari. Proses spermiogenesis pada pria berlangsung selama 72 hari. Tujuh subyek (n=7) pria diberi perlakuan dengan mengkonsumsi kapsul yang mengandung 450,5 mg ekstrak etanol 70% daun Justicia gendarussa Burm F selama 72 hari. Lalu 72 hari sebelumnya subyek tidak diberi perlakuan, digunakan sebagai masa rekoveri. Penelitian menggunakan metode HPLC dengan kolom Waters Novapak C-18, kondisi fase gerak isokratik metanol: air (30:70), kecepatan alir 1,0 ml/menit, suhu kolom 30 o

C, dan panjang gelombang 270 nm. Waktu retensi stándar gendarusin A sekitar 11 menit, LOD 0,0963 ug/ml, dan LOQ 0,3208 ug/ml. Hasil yang diperoleh adalah konsentrasi gendarusin A dalam urin subyek pada hari ke-72 (jam kelima) 37,530-149,625 ug (rata-rata 89,936 + 50,13 ug). Pada hari ke-144 setelah perlakuan tidak terdeteksi senyawa gendarusin

A dalam urin (konsentrasi < LOD).

2.5. Bioavaibilitas, Absorbsi, Distribusi, Metabolisme dan Eksresi dari

Flavonoid. Bila mengikuti proses pencernaan dari konsumsi flavonoid secara

oral (dalam bentuk aglikon atau terkonjugasi dengan glikosida), hanya sebagian kecil persentase yang dapat mencapai sirkulasi sistemik dan jaringan, dan sebagian kecil lagi dari flavonoid yang terabsorbsi berada dalam struktur aslinya.

Konjugasi Flavonoid Glikosida

Difusi Pasif

Sel epitel usus halus

Liver

SGLT-1

Aglikon Metabolit

Konversi lebih jauh

Transport sirkulasi

enterohepatik Metabolit glukoronat Sebagian besar metabolit

kembali ke usus halus

Usus besar

Aglikon

Flavonoid dan metabolitnya tidak

terabsorbsi dalam usus halus

Darah

Metabolit

Mikroflora kolon

Asam fenolat dan

Asam fenolat dan hidroksisinamat hidroksisinamat

Gambar 2.8. Skema bioavaibilitas, absorbsi, distribusi, metabolisme dan eksresi dari flavonoid (Bageta et al, 2012).

Dari gambar diatas secara singkat dapat dijelaskan mengenai metabolisme flavonoid dari tumbuhan setelah pemberian oral. Flavonoid yang terkonjugasi dengan glikosida akan mengalami hidrolisis oleh Lactase Phloridizin Hydrolase (LPH) di brush border dari sel epitel usus halus menghasilkan aglikon. LPH bekerja pada substrat yang luas dengan spesifikasi pada flavonoid-glukosida dan menghasilkan aglikon yang kemudian menembus sel epitel dengan mekanisme difusi pasif sebagai hasil dari peningkatan lipofilisitas. Hidrolisis alternatif dilakukan oleh cytosolic β glucosidase (CBG) dengan mekanisme transport aktif menggunakan sodium-dependent glucose transporter SGLT1 untuk membawa glukosida yang polar ke dalam sel epitel. Sebelum mencapai perjalanan lebih lanjut dalam aliran darah aglikon tersebut mengalami metabolisme membentuk sulfat, glukoronat, dan atau metilasi metabolit dengan masing-masing aksi dari

uridine- 5’-diphosphatase glucoronosyl-transferases (UGTs), dan catechol-O-methyltransferases (COMT). Ada juga sedikitnya beberapa metabolit kembali ke dalam lumen usus halus dan ini mungkin melibatkan transport dari multidrug resistance protein (MRP) dan P-glycoprotein (P-gp). Sesudah mencapai pembuluh darah, metabolit mengalami metabolisme fase II dengan konversi lebih jauh terjadi di dalam liver, dengan aliran transport enterohepatik dalam empedu yang tinggi menyebabkan sebagian besar metabolit mengalami siklus kembali ke dalam usus halus. Sebagian kecil flavonoid dan metabolitnya yang tidak terabsorbsi di usus kecil kemudian terabsorbsi di usus besar namun mengalami pemecahan oleh mikroflora kolon. Mikroflora kolon kemudian memecah setengah konjugasi dan menghasilkan aglikon yang akan mengalami pemecahan cincin kemudian menghasilkan asam fenolat

enzim sulfotransferases

(SULT), (SULT),

Deglikosilasi pada glikosida flavonoid merupakan metabolisme fase I. (Day et al, 2000). Dengan menggunakan usus halus manusia dan ekstrak bebas sel hati untuk mengetahui apakah ada aktivitas glukosidase terhadap glikosida flavonoid. Beberapa tetapi tidak semua glikosida flavonoid dihidrolisa oleh usus halus dan ekstrak hati. Setelah diabsorpsi, flavonoid berikatan dengan albumin dan diangkut ke hati melalui vena porta (Manach et al, 2005).

2.6 Tinjauan Tentang Analisis Biotransformasi Flavonoid Dengan LC- MS/MS.

Metode yang digunakan untuk analisis fitoestrogen dan konjugasinya dalam urin manusia menggunakan liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Senyawa yang stabil secara isotop berlabel ( 13 C ) daidzein dan ( 3 13 C 3 ) genistein (merupakan senyawa sintesis) dan digunakan sebagai standar internal untuk pengenceran isotop spektrometri massa. Daidzein dan genistein merupakan aglikon flavonoid golongan isoflavon. Aglikon bebas dan glucuronide lengkap, sulfat, diglucuronide, disulfat, serta campuran konjugasi sulfoglucuronide isoflavon dan lignan yang diamati pada terjadi Senyawa yang stabil secara isotop berlabel ( 13 C ) daidzein dan ( 3 13 C 3 ) genistein (merupakan senyawa sintesis) dan digunakan sebagai standar internal untuk pengenceran isotop spektrometri massa. Daidzein dan genistein merupakan aglikon flavonoid golongan isoflavon. Aglikon bebas dan glucuronide lengkap, sulfat, diglucuronide, disulfat, serta campuran konjugasi sulfoglucuronide isoflavon dan lignan yang diamati pada terjadi

Dua puluh satu metabolit flavonol telah diidentifikasi dengan LC/ESI-MS/MS dalam urin manusia, termasuk isomernya setelah enam subyek (5 wanita dan 1 pria) mengkonsumsi bawang yang dimasak. Metabolit yang teridentifikasi meliputi kuersetin monoglukoronat, metil kuersetin monoglukoronat, suatu sulfat monoglukuronat kuersetin, kuersetin diglukuronat, metil kuersetin diglukuronat, kuersetin glukosida sulfat, metil quercetin, kuersetin, kaempferol dan monoglukuronat. Dua isomer glukosida kuersetin sulfat juga ditemukan dalam urin, menunjukkan bahwa banyak dari glukosida quercetin dalam bawang diserap lengkap dan menjalani metabolisme terkonjugat sulfat. Selain itu, variasi antarindividu pada profil metabolit kuersetin di urin ditentukan dengan membandingkan tingkat relatif dari enam metabolit kuersetin berbeda yang diekskresikan dalam urin dari sukarelawan yang sehat. Kisaran metabolit kuersetin diekskresikan adalah serupa antara relawan, belum ada perbedaan di jumlah metabolit antara individu-individu yang diamati (Yun dan Alyson, 2004).