TEKNIK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH Antioksidan alami banyak terdapat dalam tanaman pada seluruh bagian dari tanaman seperti akar, daun, bunga, biji, batang dan sebagainya. Senyawa- senyawa yang umumnya terkandung dalam antioksidan alami adalah fenol, polifenol, dan yang paling umum adalah flavonoid flavonol, isoflavon, flavon, katekin, flavonon, turunan asam sinamat, tokoferol, dan asam organik polifungsi Pratt, et al., 1990. Pada metode DPPH free radical scavenging activity, DPPH 1,1 – diphenyl –2–picrylhydrazil digunakan sebagai model radikal bebas Hatano, et al., 1988. Jika senyawa ini masuk dalam tubuh manusia dan tidak terkendalikan dapat menyebabkan kerusakan fungsi sel. Dalam pengujian, inkubasi pada suhu 37 C dimaksudkan untuk mengoptimalkan aktivitas DPPH. Aktivitas antioksidan pada metode DPPH dinyatakan dengan IC 50 Inhibition Concentration. IC 50 adalah bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas DPPH sebesar 50. Semakin kecil nilai IC 50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan. Secara spesifik, suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC 50 kurang dari 0,05 mgmL, kuat untuk IC 50 antara 0,05-0,1 mgmL, sedang jika IC 50 bernilai 0,101 –0,150 mgmL dan lemah jika IC 50 bernilai 0,151 – 0,200 mgmL.

2.4 TEKNIK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA

2.4.1 Tinjauan Tentang Ekstraksi 2.4.1.1 Pengertian Ekstraksi Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan suatu padatan atau cairan. Proses ekstraksi mula-mula terjadi penggumpalan ekstrak dalam pelarut. Terjadi kontak antar muka bahan dan pelarut sehingga pada bidang muka terjadi pengendapan massa dengan cara difusi. Bahan ekstraksi yang telah bercampur dengan pelarut maka pelarut menembus kapiler dalam suatu bahan padat dan melarutkan ekstrak larutan dengan konsentrasi lebih tinggi terbentuk dibagian dalam bahan ekstraksi. Serta dengan cara difusi akan UIN SYARIF HIDAYATULLAH terjadi keseimbangan konsentrasi larutan dengan larutan diluar bahan Bernasconi, et al., 1995. Penggunaan metode ekstraksi yang dilakukan bergantung pada beberapa faktor, yaitu tujuan dilakukan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat-sifat komponen yang akan diekstraksi, dan sifat-sifat pelarut yang akan digunakan Hougton dan Raman, 1998. Beberapa metode ekstraksi yang sering digunakan adalah ekstraksi dengan pelarut, distilasi, super critical fluid extraction SFE, pengepresan mekanik, dan sublimasi. Metode ekstraksi yang banyak digunakan adalah distilasi dan ekstraksi dengan pelarut. Proses ekstraksi dipengaruhi oleh lama ekstraksi, suhu, dan jenis pelarut yang digunakan. Semakin dekat tingkat kepolaran pelarut dengan komponen yang diekstrak, semakin sempurna proses ekstraksi. Bernasconi, et al., 1995 menyatakan bahwa metode ekstraksi dibagi menjadi dua yaitu ekstraksi tunggal dan ekstraksi multi tahap. Ekstraksi tunggal adalah dengan mencampurkan bahan yang akan diekstrak dihubungkan satu kali dengan pelarut. Disini sebagian dari zat yang akan diolah akan larut dalam bahan pelarut sampai tercapai suatu keseimbangan. Metode ekstraksi tunggal mempunyai kekurangan yaitu rendemennya rendah. Sedangkan ekstraksi multi tahap, bahan yang akan diekstrak dihubungkan beberapa kali dengan bahan pelarut yang baru dalam jumlah yang sama besar. Setelah melalui beberapa kali pencampuran dan pemisahan maka didapatkan berbagai ekstrak dengan rendemen yang lebih tinggi daripada ekstraksi tunggal. Jumlah pelarut berpengaruh terhadap efisiensi ekstraksi, tetapi jumlah berlebihan tidak akan mengekstrak lebih banyak, dalam jumlah tertentu pelarut dapat bekerja optimal Susanto, 1999. 2.4.1.2 Pengertian dan Metode Pembuatan ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut disiapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian UIN SYARIF HIDAYATULLAH hingga memenuhi baku yang ditetapkan Depkes RI, 1995. Terdapat beberapa metode ekstraksi, yaitu: 1 Cara Dingin  Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan kamar. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat, dan seterusnya.  Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses perkolasi terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya penetesanpenampungan ekstrak, terus-menerus sampai diperoleh ekstrak perkolat Depkes RI, 2000 2 Cara Panas  Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu dan dalam jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendinginan balik Depkes RI, 2000.  Digesti Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur kamar yaitu pada 40-50 C Depkes RI, 2000. UIN SYARIF HIDAYATULLAH  Dekok Dekok adalah ekstraksi menggunakan pelarut air pada temperatur terukur 90 C selama 30 menit.  Infus Infus adalah ekstraksi menggunakan pelarut air pada temperatur penangas air bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 90 C selama 15 menit Depkes RI, 2000.  Sokletasi Sokletasi adalah metode ekstraksi untuk bahan yang tahan pemanasan dengan cara meletakkan bahan yang akan diekstraksi dalam sebuah kantung ekstraksi kertas saring di dalam sebuah alat ekstraksi dari gelas yang bekerja kontinu Voigt, 1995 2.4.2 Metode Identifikasi Senyawa dan Penentuan Strukur Suatu senyawa murni hasil isolasi akan diidentifikasi secara kimia, fisika dan dengan spektroskopi. Diantara metode identifikasi dan elusidasi struktur yang diperoleh dapat dilakukan dengan metoda standar yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia dan termasuk derivatnya antara lain dengan metoda spektroskopi dan metoda kromatografi Silverstein, 1991. 2.4.2.1 Spektroskopi Spektroskopi adalah studi mengenai interaksi energi cahaya dan materi. Tekhnik spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan struktur senyawa yang tak diketahui dan untuk mempelajari karakteristik ikatan dari senyawa yang diketahui Fessenden, 1986. a Spektroskopi Ultraviolet-Cahaya Tampak UV-Visible Spekrtoskopi UV-Visible memiliki radiasi pada panjang gelombang 200- 700 nm yang dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron-elektron UIN SYARIF HIDAYATULLAH pada ikatan di dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga menempati keadaan kuantum yang lebih tinggi dan dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan tersebut. Semakin longgar elektron tersebut ditahan di dalam ikatan molekul, semakin panjang gelombang radiasi yang diserap Watson, 2009. Radiasi di daerah UV-Visibel diserap melalui eksitasi elektron-elektron yang terlibat dalam ikatan-ikatan antara atom-atom pembentuk molekul sehingga awan elektron menahan atom-atom bersama-sama mendistribusikan kembali atom-atom itu sendiri dan orbital yang ditempati oleh elektron- elektron pengikat tidak lagi bertumpang tindih. Radiasi UV panjang gelombang pendek 150 nm 8,3 Ev dapat menyebabkan putusnya ikatan paling kuat di dalam molekul organik sehingga sangat membahayakan organisme hidup Watson, 2009. b Spektrofotometri Inframerah Spektrofotometri inframerah memiliki rentang radiasi elektromagnetik berkisar 400 cm -1 dan 4000 cm -1 2500 dan 20000 nm dilewatkan pada suatu sampel diserap oleh ikatan-ikatan molekul di dalam sampel sehingga molekul di dalam sampel tersebut meregang dan menekuk. Panjang gelombang radiasi yang diserap merupakan ciri khas ikatan yang menyerapnya Watson, 2009. Daerah pada spektrum inframerah diatas 1200 cm -1 menunjukkan pita spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus fungsi dalam molekul yang telah ditelaah. Daerah dibawah 1200 cm -1 menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul, dan karena kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik jari. Intensitas berbagai pita direkam secara subjektif pada skala sederhana: kuat, menengah atau lemah Harborne, 1987. Banyak gugus fungsi dapat diidentifikasikan dengan menggunakan Spektroskpi inframerah karena cara ini merupakan yang paling sederhana dan dapat diandalkan untuk menentukan golongan senyawa. UIN SYARIF HIDAYATULLAH c Spektrofotometer massa Suatu spektrofotometer massa bekerja dengan membangkitkan molekul- molekul bermuatan atau fragmen-fragmen molekul baik dalam keadaan sangat hampa atau segera sebelum sampel memasuki ruangan sangat hampa. Molekul terionisasi harus dibangkitkan dalam fase gas. Sewaktu muatan sudah bermuatan dan berada dalam fase gas, molekul-molekul tersebut dapat dimanipulasi dengan penerapan medan listrik atau medan magnet agar dapat menentukan bobot molekulnya dan bobot molekul semua fragmen yang dihasilkan dari pemecah molekul Watson, 2009. Kromatografi gas - spektrometri massa merupakan kombinasi pemisahan antara kromatografi gas menggunakan deteksi spektrofotometri massa. Kromatografi gas dihubungkan dengan spektrofotometri massa melalui suatu separator jet dengan eluen kolom dilewatkan melalui celah yang sangat sempit diantara dua jet dan gas pembawa yang sangat mudah berdifusi sebagian besar dihilangkan Watson, 2009. d Resonansi Magnetik Inti Radiasi pada daerah frekuensi radio digunakan untuk mengeksitasi atom- atom, biasanya proton-proton atau atom-atom karbon-13, sehingga spinnya berubah dari sejajar menjadi sejajar melawan medan magnet yang digunakan. Rentang frekuensi yang dibutuhkan untuk eksitasi dan pola-pola pembagian kompleks yang dihasilkan sangat khas pada struktur kimia molekul tersebut Watson, 2009. RMI proton I H adalah bentuk RMI yang paling banyak digunakan karena kepekaanya dan banyaknya informasi struktur yang dihasilkan. Serapan atau frekuensi resonansi yang pasti pada suatu proton bergantung pada lingkungannya Watson, 2009. 2.4.2.2 Kromatografi Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran berdasarkan perbedaan migrasi analit diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase UIN SYARIF HIDAYATULLAH geraknya, dimana fase diam merupakan zat padat dan fase gerak merupakan zat cair atau gas Sudjadi, 1985. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen- komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase, yaitu fase diam stationer dan fase gerak mobile. Adrianingsih 2009 menyatakan bahwa persyaratan utama kromatografi adalah : 1. Ada fase diam dan fase gerak. Fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase gerak. 2. Komponen sampel harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi dengan fase diam. 3. Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam harus terikat kuat di posisinya. Jenis – jenis kromatografi antara lain : a Kromatografi lapis tipis KLT Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan fisika, kimia dan kromatografi cair paling sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca atau plat aluminium yang dilapisi silika gel dan menggunakan pelarut tertentu Harborne, 1987. Pemisahan senyawa yang sangat berbeda kepolarannya seperti senyawa organik alam dengan senyawa organik sintetik, kompleks organik-organik dan ion anorganik dapat menggunakan kromatografi laps tipis. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam uniform pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium atau plat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini adalah bentuk terbuka dari kromatografi kolom Gritter, et al., 1991. Pemisahan pada KLT akan optimal jika sampel ditotolkan dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Setelah sampel ditotolkan pada lempeng KLT, tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel tersebut UIN SYARIF HIDAYATULLAH dalam suatu bejana kromatografi chamber yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak. Selama proses pengembangan, bejana kromatografi harus tertutup rapat. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi, dilakukan deteksi bercak Gandjar dan Rohman, 2007. Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai Retardation factor Rf. Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak Gandjar dan Rohman, 2007. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom Gritter, et al., 1991. KLT merupakan teknik yang benar-benar menguntungkan karena tingkat kesensitifannya sangat besar dan konsekuensinya jumlah sampel lebih sedikit Brain dan Turner, 1975. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang atau cairan pengelusi akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengambangan secara mekanik ascending, atau karena pengaruh grafitasi pada pengembang menurun descending Gritter, et al., 1991. Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang memiliki tingkat polaritas tertentu, mampu melarutkan senyawa, dan tidak bereaksi dengan adsorban Gritter, et al., 1991. Ada beberapa kemungkinan cara mendeteksi senyawa tidak berwarna pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan di daerah UV gelombang pendek radiasi utama kira-kira 254 nm atau jika senyawa itu dapat dieksitasi ke fluoresensi radiasi UV gelombang pendek dan gelombang panjang 365 nm. Pada senyawa yang mempuyai dua ikatan rangkap atau lebih dan senyawa aromatik seperti UIN SYARIF HIDAYATULLAH turunan benzena, mempunyai serapan kuat ± di daerah 230-300 nm stahl, 1985. Harga Rf Retardation factor merupakan parameter karakterristik KLT. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut: Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standar. Harga-harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan Sastrohamidjojo, 2005. Nilai Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standar. Nilai-nilai Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan Sastrohamidjojo, 2005. Faktor yang mempengaruhi bercak dan harga Rf dari KLT antara lain struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, sifat dari fase diam, tebal dan kerataan dari fase diam, derajat kemurnian dari fase gerak, serta derajat kejenuhan uap dalam bejana pengembang yang digunakan. Jika dengan cara tersebut senyawa tidak dapat terdeteksi, maka dipakai reaksi kimia dan metode khas Stahl, 1985. Adsorban yang bisa digunakan sebagai fase diam pada kromatografi lapis tipis antara lain:  Gel silika G Gel silika G Fase diam ini memiliki ukuran rata-rata partikel 15 µm mengandung lebih kurang 13 bahan pengikat kalsium sulfat. Gel silika G banyak digunakan dalam banyak pengujian farmakope. Dalam praktik, pelat-pelat komersial dapat digunakan yang mengandung jenis pengikat yang berbeda Watson, 2009. UIN SYARIF HIDAYATULLAH  Gel silika GF 254, Gel silika GF 254, merupakan gel silika G dengan penambahan bahan berfluoresensi. Dalam penggunaan adsorben ini sama dengan pengunaan gel silika G dengan visualisasi dilakukan dibawah cahaya UV Watson, 2009.  Perlit mineral Perlit mineral merupakan adsorben baru yang digunakan untuk kromatografi lapis tipis. Adsorban ini dibuat dengan mengkonversi SiO 2 70- 75 ke silikat yang larut dengan Na 2 CO 3 . Sebuah demonstrasi dari pemisahan pewarna, asam amino, asam karboksilat, monosakarida dan disakarida, dan ion halida menggunakan lapisan bahan dicampur dengan CaSO 4 dan Na 4 SiO 4 Gocan, 2002.  Kieselguhr Fase diam ini mengandung pengikat kalsium sulfat yang digunakan sebagai penyangga padat untuk fase diam seperti parafin cair yang digunakan dalam analisis minyak lemak Watson, 2009.  Magnesium silikat Fase diam ini hanya digunakan bila adsorben atau penjerap lain tidak dapat digunakan. Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan florisil. Florisil adalah endapan silika dan magnesium. Sifat dan aplikasi dari florisil di TLC dan HPLC ditinjau dan dibandingkan dengan adsorben lainnya Gocan, 2002.  Selulose Serbuk selulosa dengan ukuran partikel kurang dari 30 µm. Polaritasnya tinggi dapat digunakan sebagai pemisah secara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk lempeng. Kedua bentuk tersebut masih sering digunakan untuk pemisahan tetrasiklin Watson, 2009. UIN SYARIF HIDAYATULLAH Polaritas fase gerak perlu diperhatikan pada analisa dengan KLT, sebaiknya digunakan campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin. Campuran yang baik memberikan fase-fase bergerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang. Secara umum dikatakan bahwa fase diam yang polar akan mengikat senyawa polar dengan kuat sehingga bahan yang kurang sifat kepolarannya akan bergerak lebih cepat dibandingkan bahan-bahan polar Gritter, 1991. Pelarut yang ideal harus melarutkan linarut senyawa yang dipisahkan dan harus cukup baik sebagai pelarut yang bersaing dengan daya serap penyerap. Keadaan tersebut mungkin terjadi jika pelarut tidak berproton seperti hidrokarbon, eter dan senyawa karbonil dipakai sebagai pelarut pengembang Gritter, 1991. Menurut Heinrich, et al., 2004 ada sejumlah keuntungan dari metode ini untuk analisis dan isolasi dari aktivitas biologis produk alam: 1. Biayanya lebih murah dibandingkan dengan metode instrumen dan membutuhkan sedikit pengetahuan dan pelatihan pada kromatografi. 2. Mudah menaikkan skala dari analisis ke mode preparatif dengan isolasi cepat dari miligram untuk jumlah gram produk. 3. Fleksibel dalam memilih fase diam dan fase geraknya. 4. Pemisahan dapat dengan mudah dioptimalkan untuk salah satu komponen dan metodenya cepat. 5. Sampel dalam jumlah besar dapat dianalisis atau dipisahkan secara bersamaan. 6. pemisahan apapun dapat dicapai dengan fase gerak dan diam yang sesuai. b Kromatografi kolom Kromatografi kolom termasuk kedalam kromatografi serapan. Metode kromatografi ini digunakan untuk memisahkan senyawa dalam jumlah yang cukup banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Fase gerak dibiarkan mengalir melalui kolom. Aliran tersebut disebabkan oleh adanya gaya berat atau dengan didorong dengan tekanan. UIN SYARIF HIDAYATULLAH Pada kromatografi kolom, tabung pemisah diisi penjerap. Penjerap yang biasa digunakan adalah silika gel. Pengisian ini harus dilakukan secara berhati-hati dan merata. Penjerap dapat dikemas dalam tabung dengan cara basah maupun kering Harborne, 1987. Kromatografi kolom dengan cara basah, silika gel terlebih dahulu dijenuhkan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan. Kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinu sedikit demi sedikit, sambil keran kolom dibuka. Pelarut dialirkan hingga silika gel mampat. Setelah silika gel mampat, pelarut dibiarkan mengalir hingga batas adsorben. Kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan, sampel yang dimasukkan terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut hingga diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga sampel semua masuk. Selanjutnya kran dibuka dan diatur tetesannya, serta ditambahakan dengan cairan pengelusi. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi Gritter, 1991. Sedangkan cara kering, yaitu dengan memasukkan silika gel ke dalam kolom yang telah diberi kapas sedikit demi sedikit dan diratakan dengan alat pemampat kemudian ditambahkan dengan cairan pengelusi Gritter, 1991

2.5 PELARUT