HASIL ISOLASI DAN UJI KEMURNIAN SENYAWA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH

4.5. HASIL ISOLASI DAN UJI KEMURNIAN SENYAWA

4.5.1 Kromatografi kolom ekstrak kental n-heksana Kromatografi kolom I Ekstrak kental n-heksana dilakukan pemisahan dengan metode kromatografi kolom. Kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 130 cm dan diameter 4 cm. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 GF254 ukuran partikel 0,063-0.2 mm. Kolom yang akan digunakan dibersihkan dahulu lalu pada bagian dasarnya diberikan kapas. Selanjutnya kolom dialiri dengan pelarut n-heksana dan kapas ditekan-tekan dengan batang pengaduk hingga tidak ada udara yang terjerap. Buat bubur silika dengan menimbang serbuk silika gel sebanyak 200 gram lalu dispersikan dengan pelarut n-heksana hingga menjadi suspensi silika. Bubur silika gel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi sedikit demi sedikit. Kolom dialiri dengan pelarut n-heksana, pelarut yang menetes, ditampung, kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom sambil diketuk-ketuk. Proses ini dilakukan hingga silika gel mampat. Ekstrak kental n-heksana sebanyak 15 gram yang akan dipisahkan sebelumnya dicampur dengan silika gel sebanyak 8 gram untuk preadsorbsi. Selanjutnya masukkan sedikit-sedikit ke dalam kolom dan masukkan sumbat kapas. Sistem fase gerak yang digunakan yaitu campuran pelarut n-heksana dan etil asetat yang kepolarannya dinaikkan secara bertahap dengan mengatur komposisi campuran masing-masing fraksi. Masing-masing fase gerak digunakan sebanyak 250 ml dengan perbandingan n-heksana dan etil asetat yang setiap gradien kepolarannya ditingkatkan sebanyak 10. Fraksinasi pertama dilakukan dengan mengaliri kolom dengan fase gerak n-heksana 100 sebanyak 250 mL. Pelarut yang menetes ditampung dalam vial yang sebelumnya telah diberi nomor. Fraksinasi dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100. Pada tahap akhir kromatografi kolom, kolom dicuci dengan mengaliri pelarut metanol 100 sebanyak 300 mL untuk membersihkan silika gel dari sisa ekstrak yang masih menempel. Dari hasil kromatografi kolom, diperoleh fraksi sebanyak 250 fraksi. Setiap fraksi yang diperoleh, dilakukan kromatografi lapis tipis dan dilihat pola bercak yang UIN SYARIF HIDAYATULLAH dihasilkan dibawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Pada plat KLT dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan menyemprot reagen DPPH dengan konsentrasi 0,04. Fraksi yang memberikan bercak dengan nilai Rf yang sama di gabungkan dalam satu vial yang selanjutnya akan dilakukan pemisahan kembali dengan kromatografi kolom. Dari 250 fraksi, diperoleh 14 sub fraksi antara lain F1.A merupakan hasil fraksi No.1-22, F1.B merupakan gabungan dari fraksi No. 23-42, F1.C merupakan gabungan dari fraksi No.43-48, F1.D merupakan gabungan dari fraksi No.49-57, F1.E merupakan gabungan dari fraksi No.58-72, F1.F merupakan gabungan dari fraksi No.73-81, F1.G merupakan gabungan dari fraksi No.82-93, F1.H merupakan gabungan dari fraksi No.94-114, F1.I merupakan gabungan dari fraksi No. 115-122, F1.J merupakan gabungan dari fraksi No.123-140, F1.K merupakan gabung dari fraksi No.141-161, F1.L merupakan gabungan dari fraksi No. 162-170. F1.M merupakan gabungan dari fraksi No. 171-214 dan F1.N merupakan gabungan dari fraksi No. 215-250. Terdapat 14 sub fraksi yang memberikan pola bercak yang sama. Bercak antioksidan yang akan dijadikan senyawa target untuk diisolasi terdapat pada fraksi F1.B dengan bobot 6,064 gram, sehingga fraksi tersebut dilakukan pemisahan lebih lanjut dengan kromatografi kolom. 4.5.2 Kromatografi Kolom dari Fraksi F1.B kromatografi kolom II Dari uji bercak dengan kromatografi lapis tipis tidak memberikan pemisahan yang baik dengan Rf yang berdekatan. Oleh karena itu, dilakukan lagi pemisahan fraksi F1.B sebanyak 6,064 gram untuk memperoleh senyawa yang lebih murni. Fraksi F1.B merupakan minyak padat yang berwarna oranye. Pada kromatografi kolom II, kolom yang digunakan memiliki ukuran tinggi 75 cm dan diameter 3 cm, serta silika gel yang digunakan sebanyak 60 gram. Fase gerak yang digunakan adalah n-heksana dan etil asetat dengan sistem gradien, setiap gradien kepolarannya ditingkatkan sebanyak 10. Prosedur pengerjaan sesuai dengan kegiatan kromatografi kolom sebelumnya. Dari hasil kromatografi kolom II diperoleh fraksi sebanyak 188 fraksi yang selanjutnya dilakukan KLT dan diuji aktivitas antioksidannya dengan DPPH UIN SYARIF HIDAYATULLAH 0,04. Dari 188 fraksi diperoleh 12 sub fraksi dari hasil gabungan fraksi yang memiliki pola bercak yang sama antara lain, F2.A merupakan hasil fraksi No.1-5, F2.B merupakan gabungan dari fraksi No. 6-33, F2.C merupakan gabungan dari fraksi No. 34-39, F2.D merupakan gabungan dari fraksi No.40-49, F2.E merupakan gabungan dari fraksi No.50-64, F2.F merupakan gabungan dari fraksi No. 65-76, F2.G merupakan gabungan dari fraksi No. 77-88, F2.H merupakan gabungan dari fraksi No.89-106, F2.I merupakan gabungan dari fraksi No. 107- 136, F2.J merupakan gabungan dari fraksi No.137-151, F2.K merupakan gabung dari fraksi No.152-157, dan F2.L merupakan gabungan dari fraksi No. 158-188. Dari 12 sub fraksi yang ada, Senyawa target yang memilki aktivitas antioksidan yang kemungkinan kuat terdapat pada fraksi F2.B dengan bobot 3,658 gram. Oleh karena itu, fraksi tersebut dilkakukan pemisahan kembali untuk memperoleh senyawa yang lebih murni. 4.5.3 Kromatografi Kolom Dari Fraksi F2.B kromatografi kolom III Pada kromatografi kolom III, kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 75 cm dengan diameter 3 cm dan silika gel sebanyak 40 gram. Fase gerak yang digunakan sama dengan kromatografi kolom sebelumnya, kepolarannya ditingkatkan sebanyak 10. Fraksinasi dilakukan dimulai dari fase gerak n-heksana 100 dan diakhiri dengan fase gerak etil asetat 100. Dari hasil kromatografi kolom III diperoleh 113 fraksi yang kemudian dilakukan uji uv dan uji kualitatif antioksidan dengan DPPH 0,04 . Dari113 fraksi didapatkan 4 sub fraksi dari hasil gabungan fraksi yang memiliki pola bercak yang sama antara lain, F3.A merupakan hasil fraksi No.1-78, F3.B merupakan gabungan dari fraksi No. 79-95, F3.C merupakan gabungan dari fraksi No. 96-102, dan F3.D merupakan gabungan dari fraksi No.103-113. Dari 4 sub fraksi yang ada, Senyawa target yang memilki aktivitas antioksidan yang kemungkinan kuat terdapat pada fraksi F3.B dengan bobot 135 mg. Dari uji bercak dengan kromatografi lapis tipis tidak memberikan pemisahan yang baik dengan Rf yang berdekatan. Oleh karena itu, fraksi tersebut dilakukan pemisahan kembali untuk memperoleh senyawa yang lebih murni. UIN SYARIF HIDAYATULLAH 4.5.4 Kromatografi Kolom Dari Fraksi F3.B kromatografi kolom IV Pada kromatografi kolom IV, kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 30 cm dengan diameter 1,5 cm dan silika gel sebanyak 4 gram. Fase gerak yang digunakan sama dengan kromatografi kolom sebelumnya, tetapi setiap gradien, kepolarannya ditingkatkan sebanyak 1. Fraksinasi dilakukan dimulai dari fase gerak n-heksana 100 dan diakhiri dengan fase gerak n-heksana : etil asetat 85 : 15. Dari hasil kromatografi kolom IV diperoleh 54 fraksi yang kemudian dilakukan uji uv dan uji kualitatif antioksidan dengan DPPH 0,04 . Dari 54 fraksi didapatkan 3 sub fraksi dari hasil gabungan fraksi yang memiliki pola bercak yang sama antara lain, F4.A merupakan hasil fraksi No.22, F4.B merupakan gabungan dari fraksi No. 23-40, dan F3.C merupakan gabungan dari fraksi No.41-54. Dari uji bercak dengan kromatografi lapis tipis dan dilakukan uji uv dan disemprot dengan DPPH 0,04. Fraksi F4.A merupakan minyak yang berwarna kuning dan pada uji KLT memberikan satu bercak pada pelat KLT. Oleh karena itu, F4.A dilakukan kromatografi lapis tipis dua arah untuk mengetahui kemurniannya. Pada fraksi F4.B yang berbobot 30 mg juga terdapat senyawa target tetapi tidak memberikan pemisahan yang baik dengan adanya Rf yang berdekatan. Oleh karena itu, fraksi tersebut dilakukan pemisahan kembali untuk memperoleh senyawa yang lebih murni. 4.5.5 Kromatografi Kolom Dari Fraksi F4.B kromatografi kolom V Pada kromatografi kolom V, kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 30 cm dengan diameter 1,5 cm dan silika gel sebanyak 2 gram. Fase gerak yang digunakan sama dengan kromatografi kolom sebelumnya, tetapi setiap gradien, kepolarannya ditingkatkan sebanyak 1. Fraksinasi dilakukan dimulai dari fase gerak n-heksana 100 dan diakhiri dengan fase gerak n-heksana : etil asetat 95:5. UIN SYARIF HIDAYATULLAH Dari hasil kromatografi kolom V diperoleh 23 fraksi yang kemudian dilakukan uji uv dan uji kualitatif antioksidan dengan DPPH 0,04 . Setelah dilakukan uji KLT diperoleh satu bercak pada pada fraksi No 4,5,6,7, dan 8. Keempat fraksi tersebut digabung F5.B lalu dilakukan uji kromatografi lapis tipis dua arah untuk menguji kemurniannya. Terdapat isolat yang diperoleh dari kromatografi kolom IV yaitu pada fraksi F4.A dan isolat yang diperoleh dari kromatografi kolom V yaitu pada fraksi F5.B. Karakteristik senyawa yang diperoleh tertera pada tabel 4.3 dibawah ini. Tabel 4.3. Karakteristik senyawa hasil isolasi Fraksi Organoleptis Rf Bobot F4.A Bentuk: Minyak Warna: Kuning 0,5 5,1 mg F5.B Bentuk: Minyak Warna: Kuning 0,5 2 mg Setelah dilakukan kromatografi lapis tipis, kedua isolat tersebut memiliki nilai Rf yang sama. Sehingga dapat disimpulkan bahwa isolat dari kedua fraksi tersebut merupakan senyawa yang sama. Kedua isolat tersebut dilakukan penggabungan NF.1 dan setelah dilakukan uji kemurnian dengan kromatografi lapis tipis dua arah diperoleh bercak tunggal dengan nilai Rf 0,5. Sehingga, dapat disimpulkan bahwa senyawa tersebut telah murni Lampiran 4.

4.6. PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA MURNI