III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan
Tongkol jagung hibrida CP 2 yang dibusukkan digunakan sebagai sumber mikroba yang diisolasi. Selain itu juga digunakan beberapa kultur
koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia yaitu Bacillus pumilus Y1, B. licheniformis
MB2, Pseudomonas syringae, P. fluorescens, dan beberapa strain Xanthomonas axonopodis campestris pv. glycines Xag R8, Xag
YR58, Xag YR63 dan Xag YR69. Untuk mendapatkan plasmid, juga digunakan isolat Escherichia coli DH5
α carrier plasmid pRK415 dan E. coli DH5
α carrier plasmid pBR322. Media yang digunakan dalam screening adalah media Dung et al. 1993
yang terdiri dari ekstrak khamir, oat spelt xylan, garam-garam NaCl, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, NH
4
Cl, Na
2
HPO
4
dengan pH 7,0. Media pertumbuhan yang digunakan adalah media Luria Bertani LB yang terdiri dari tripton, ekstrak
khamir, dan garam NaCl dengan pH 7,0. Untuk media pertumbuhan E. coli pembawa plasmid dilakukan penambahan antibiotik tetrasiklin. Media
penyegaran kultur X. axonopodis campestris pv. glycines adalah media Yeast Dextrose Carbonate
, yang terdiri dari ekstrak khamir, dekstrosa, CaCO
3
, dan agar. Komposisi media dan cara pembuatannya dapat dilihat pada Lampiran 1.
Buffer dalam tahap sonikasi terdiri dari Tris-HCl 10 mM pH 7,5, Na
2
EDTA 1 mM, dan β-merkaptoetanol 7 mM. Enzim restriksi diekstrak
dengan akuabides steril, NaCl 2 M, dan polimer konsentrat. Polimer konsentrat terdiri dari polietilen glikol PEG 8000 28,4 ww, dekstran
T500 7,1 ww. Cara pembuatan polimer konsentrat dapat dilihat pada Lampiran 2.
Ekstrak enzim restriksi diujikan aktivitasnya dengan bahan-bahan seperti buffer reaksi yang dibuat menjadi stok 10
×, DNA fage lambda komersial dari New England Biolabs
NEB, enzim restriksi komersial PstI dan HindIII dari Gibco BRL, dan akuabides steril. Buffer reaksi yang digunakan bervariasi
pada komposisi dan konsentrasi garamnya. Untuk mendapatkan konsentrasi Mg
2+
yang optimum, digunakan buffer reaksi 10 × yang mengandung Tris-HCl
100 mM dengan konsentrasi MgCl
2
yang dibuat bervariasi, yaitu 70 mM, 100 mM, 120 mM, dan 170 mM, serta
β-merkaptoetanol 70 mM. Juga dilakukan penambahan Bovine Serum Albumin BSA dengan konsentrasi 1 mgml.
Untuk melihat pengaruh kekuatan ion digunakan buffer 10 × yang
mengandung Tris-HCl 100 mM, MgCl
2
70 mM, β-merkaptoetanol 70 mM,
dan garam NaCl atau KCl dengan konsentrasi 50 mM atau 100 mM. Bahan-bahan dalam elektroforesis gel agarosa terdiri dari gel loading
buffer , gel agarosa, buffer TAE 10
×, dan ethidium bromida. Komposisi gel loading buffer
dan buffer TAE dapat dilihat pada Lampiran 3.
B. Alat
Kategori