yang tidak analog dengan DNA kromosomal. DNA ini memiliki banyak situs yang dapat dikenali dan dipotong oleh banyak enzim
restriksi seperti terlihat pada Gambar 4. Enzim-enzim tersebut dapat memotong DNA fage lambda pada satu situs atau lebih, sehingga
terbentuk beberapa potongan fragmen DNA. Ukuran DNA fage lambda cukup besar, yaitu 48.502 pb. Ujung-ujung utas ganda
liniernya merupakan ujung menggantung 5’ sebanyak 12 pb yang bersifat komplementer Old dan Primrose, 1989.
Gambar 4. Peta restriksi DNA fage lambda Anonim
c
, 2006
2. Elektroforesis Agarosa
Setelah tahap digesti, hasil reaksi diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan fraksi-fraksi suatu
campuran berdasarkan pergerakan partikel koloid yang bermuatan
dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis digunakan untuk menganalisis virus, asam nukleat, enzim, protein, dan molekul-molekul
organik berberat molekul rendah seperti asam amino Suhartono, 1989. Untuk pemisahan fragmen DNA utas ganda, DNA akan bermuatan
negatif pada pH netral pH 7,0-8,0, sehingga dengan adanya aliran listrik, sampel DNA dalam sumur gel akan bergerak dari kutub negatif
katoda ke kutub positif anoda Suwanto, 1993. Elektroforesis memisahkan fragmen-fragmen DNA dengan
panjang yang berbeda dan konfigurasi molekul DNA yang berbeda. Jarak pergerakan dalam gel tergantung dari ukuran makromolekul, dimana
makromolekul yang berukuran lebih kecil memiliki pergerakan yang lebih jauh daripada makromolekul besar Glick dan Pasternak, 2003.
Konfigurasi molekul DNA yang berbeda seperti konfigurasi plasmid dapat dipisahkan dengan urutan kecepatan pergerakan dari yang paling
tinggi adalah superkoil, linier, dan terakhir lingkar terbuka Old dan Primrose, 1989.
Gel agarosa merupakan salah satu gel elektroforesis yang dapat digunakan dalam pengujian ukuran, keutuhan, homogenitas, dan
kemurnian DNA. Agarosa merupakan suatu polimer linear yang diperoleh dari ekstrak rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan
mencampurkan agarosa dengan larutan buffer yang sesuai dan dipanaskan sampai larutan menjadi bening. Larutan yang encer tersebut
kemudian dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan sampai membeku Sambrook et al., 1989. Agarosa membentuk gel pada kondisi dingin
akibat adanya ikatan hidrogen. Ukuran pori yang terbentuk ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Semakin tinggi konsentrasi maka ukuran pori
akan semakin kecil, sehingga kemampuan untuk memisahkan fragmen- fragmen berukuran kecil lebih baik Sambrook et al., 1989.
Gel agarosa memiliki kapasitas pemisahan yang lebih rendah dibandingkan dengan gel poliakrilamida, tetapi memiliki spektrum
pemisahan yang lebih besar. Gel poliakrilamida sangat efektif dalam pemisahan fragmen DNA yang kecil 5-500 pb. Hasil yang diperoleh
amat baik, dan fragmen DNA yang berbeda sampai 1 pb dapat dipisahkan satu sama lain. Walaupun metode ini dapat dilakukan dalam waktu yang
sangat singkat, gel poliakrilamida lebih sulit dalam penanganan dan penyiapannya daripada gel agarosa Sambrook et al., 1989. Keuntungan
elektroforesis gel agarosa ini adalah cepat, sederhana, memberikan hasil dengan resolusi tinggi, dan sangat peka karena dalam analisis hanya
dibutuhkan sampel dengan jumlah yang sedikit. Jumlah DNA sekecil 10 ng dapat terdeteksi dengan baik sebagai suatu pita Anonim
a
, 2006. Perlengkapan utama yang diperlukan pada proses elektroforesis
adalah sumber arus listrik dan sistem buffer reservoir. Sistem buffer dalam elektroforesis berfungsi untuk mempertahankan pH konstan di
dalam reservoir dan di dalam gel serta bertindak sebagai elektrolit penghantar arus listrik dalam medan listrik. Cara penggunaan buffer
untuk gel agarosa dapat dilakukan karena lebih cepat dan sederhana. Pada cara ini gel direndam satu milimeter di bawah permukaan buffer dan
DNA biasanya dicampur dengan bahan yang mempunyai densitas tinggi seperti sukrosa, ficoll, atau gliserol sebelum dimasukkan ke dalam sumur
gel. Bahan pemberat ini dicampur dengan bahan pewarna bromfenol biru dan xylene cyanol di dalam larutan penghenti reaksi atau blue juice
Suwanto, 1993. Penambahan blue juice gel loading buffer, bertujuan untuk meningkatkan densitas sampel dan memberikan warna pada
sampel untuk mempermudah pengamatan jalannya elektroforesis Sambrook et al., 1989.
Setelah elektroforesis selesai, gel direndam dalam larutan ethidium bromida dan dilakukan destaining. Destaining berfungsi untuk
menghilangkan ethidium bromida yang terikat non-spesifik pada bagian gel selain DNA. Gel diamati dengan UV-transilluminator. Sinar UV
yang dipakai ada dua macam, yaitu dengan gelombang pendek 280 nm dan gelombang panjang 310-320 nm. Gel biasanya dipotret dengan
filter jingga untuk menyaring UV, sehingga diperoleh dokumen hitam- putih yang jelas. Untuk keperluan analisa rutin lebih disukai kamera
polaroid instant photo Suwanto, 1993.
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan
