Karakteristik Enzim Endonuklease Restriksi

D. Karakteristik Enzim Endonuklease Restriksi

Bagi enzim endonuklease restriksi, satu unit U aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat memotong 1 g DNA dari fage selama 1 jam dalam kondisi buffer yang optimum pada suhu 37 o C Pingoud et al., 1993. Seperti sifat enzim pada umumnya, enzim restriksi juga membutuhkan kondisi tertentu untuk menghasilkan aktivitas pemotongan yang optimum, seperti suhu, pH, kekuatan ionik, ion Mg 2+ , waktu reaksi, dan aditif penstabil Pingoud et al., 1993. 1. Suhu Suhu optimum enzim adalah suhu dimana aktivitas enzim optimum. Peningkatan suhu hingga suhu tertentu akan menyebabkan kenaikan kecepatan reaksi enzim karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim dengan substrat, sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi Suhartono, 1989. Namun suhu yang terlalu tinggi juga dapat mempercepat pemecahan atau kerusakan enzim. Suhu merupakan parameter kritis bagi penggunaan endonuklease restriksi secara optimum. Sebagian besar endonuklease restriksi memiliki suhu optimum sekitar 37 o C. Beberapa enzim terutama yang diisolasi dari bakteri cryofilik atau termofilik membutuhkan suhu yang lebih rendah atau suhu yang lebih tinggi untuk aktivitasnya Pingoud et al., 1993. Hal ini berkaitan dengan suhu optimum yang erat hubungannya dengan suhu optimum pertumbuhan mikroba asal enzim. Parameter lingkungan ini harus diperhatikan dalam digesti oleh enzim restriksi agar reaksi berjalan optimum. 2. pH Enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yaitu mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun basa, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal aminonya. Semua reaksi enzim dipengaruhi pH medium tempat reaksi terjadi. Oleh karena itu pada setiap percobaan dengan enzim diperlukan buffer untuk mengontrol pH reaksi. Pada umumnya, enzim aktif pada pH netral, yaitu pH cairan makhluk hidup, namun kisaran kereaktifan enzim dapat mencapai pH 5-9 Suhartono, 1989. Menurut Pingoud et al. 1993, hampir semua enzim restriksi bekerja dengan baik pada range pH 7,2-8,0, meskipun beberapa enzim memiliki kisaran yang lebih sempit. 3. Kekuatan Ionik Keakuratan dan aktivitas enzim restriksi sangat dipengaruhi oleh kekuatan ionik. Kekuatan ionik yang diperlukan dapat diperoleh dengan penambahan garam NaCl atau KCl ke dalam buffer Tris-HCl. Konsentrasi dan jenis kekuatan ionik yang tepat sangat diperlukan karena kekuatan ionik yang terlalu rendah akan menginduksi aktivitas bintang dan kekuatan ionik yang terlalu tinggi dapat mengaktivasi endonuklease non-spesifik kontaminan atau menghambat enzim restriksi itu sendiri. Hampir semua enzim restriksi dapat menerima kekuatan ionik dari NaCl ataupun KCl, namun beberapa enzim restriksi hanya aktif pada kekuatan ionik yang diberikan oleh KCl, seperti enzim SmaI Pingoud et al., 1993. Tabel 3 berikut ini adalah contoh preferensi beberapa enzim terhadap suhu, pH, dan kekuatan ionik tertentu. Tabel 3. Buffer reaksi optimum enzim restriksi Pingoud et al., 1993 Nama enzim pH optimum Jenis dan konsentrasi garam Suhu optimum Keterangan Aha I 8,0 KCl 150 mM 37 o C KCl dapat digantikan oleh NaCl Bam HI 7,9 NaCl 100 mM 37 o C Konsentrasi garam 100 mM menurunkan aktivitas Eco RI 7,5 NaCl 50 mM 37 o C Konsentrasi garam 50 mM menginduksi star activity Hin dIII 8,0 NaCl 50 mM 37 o C Konsentrasi garam 50 mM dan 100 mM menurunkan aktivitas Mbo II 7,4 KCl 10 mM 37 o C Tidak sensitif terhadap konsentrasi garam Taq I 8,4 NaCl 100 mM 65 o C Aktivitas pada 37 o C separuh aktivitas pada 65 o C Xho I 8,0 NaCl 150 mM 37 o C Membutuhkan 0,01 Triton 4. Ion Mg 2+ Dalam reaksinya, enzim endonuklease restriksi membutuhkan ion Mg 2+ , meskipun beberapa enzim seperti NlaIII dan NlaIV memerlukan tambahan 50 mM NH 4 2 SO 4 untuk aktivasi enzim. Konsentrasi yang optimum berkisar antara 5-10mM MgCl 2 . Peranan Mg 2+ diduga untuk menyebabkan polarisasi ikatan fosfodiester yang akan dipotong atau untuk mengaktivasi molekul air untuk membentuk nukleofil yang dibutuhkan Pingoud et al., 1993. Dengan demikian, adanya pengkelat ion seperti EDTA dapat mengganggu aktivitas pemotongan DNA. 5. Waktu Reaksi Lamanya waktu reaksi pada umumnya ditentukan berdasarkan unit aktivitas enzim. Penggunaan enzim dalam jumlah yang lebih sedikit dimungkinkan dengan memperpanjang waktu reaksi. Hal ini tidak akan menimbulkan masalah kecuali jika terdapat kontaminasi nuklease lainnya Anonim d , 2006. 6. Aditif Penstabil Enzim restriksi juga memiliki kebutuhan akan aditif penstabil untuk mencegah terjadinya oksidasi residu sistein. Pada umumnya, aditif yang digunakan adalah 1,4-dithiothreitol, 1,4-dithioerithritol, atau β- merkaptoetanol. Aditif juga diperlukan untuk mencegah terjadinya agregasi dan presipitasi. Dalam hal ini, aditif yang umum digunakan adalah Triton X-100, Tween, Lubrol, deterjen lainnya, atau Bovine Serum Albumin BSA Pingoud et al., 1993. Pada kondisi tertentu, beberapa enzim restriksi dapat mengalami aktivitas bintang star activity. Aktivitas bintang adalah keadaan dimana enzim restriksi kehilangan spesifisitasnya terhadap sekuens DNA, sehingga selain memotong sekuens spesifik yang dikenalnya, enzim restriksi juga memotong substrat pada situs lainnya yang tidak spesifik. Hal ini dapat disebabkan kekuatan ionik yang terlalu rendah, pH buffer reaksi yang terlalu tinggi di atas 8,5, substitusi ion Mg 2+ dengan kation divalen lainnya, waktu inkubasi yang terlalu lama atau jumlah enzim yang terlalu banyak, konsentrasi gliserol yang terlalu tinggi, dan adanya pelarut organik etanol, dimetilsulfoksida Anonim b , 2006. Menurut Davis et al. 1986, faktor-faktor lain yang berhubungan dengan kondisi-kondisi reaksi seperti kemurnian DNA dan keadaan enzim itu sendiri juga mempengaruhi aktivitasnya. Metilasi DNA, ikatan dengan protein atau kekentalan yang berlebihan dari DNA berberat molekul tinggi dalam larutan yang pekat dapat menurunkan efisiensi pemotongan oleh enzim. Pada umumnya DNA yang akan dipotong harus bebas dari pengotor. Adanya RNA dan DNA utas tunggal tidak berpengaruh buruk terhadap aktivitas sebagian enzim restriksi.

E. Deteksi Aktivitas Enzim Endonuklease Restriksi