Kini telah ditemukan lebih dari 3000 jenis enzim restriksi dan banyak di antaranya yang merupakan isoschizomer atau neoschizomer. Isoschizomer
suatu enzim adalah enzim lain memiliki sekuens pengenalan dan pemotongan DNA yang sama dengan enzim tersebut Pingoud et al., 1993. Sedangkan
neoschizomer suatu enzim adalah enzim lain yang mengenal sekuens DNA
yang sama tapi memotong pada situs yang berbeda dengan enzim tersebut Roberts dan Halford, 1993.
B. Sumber Enzim Endonuklease Restriksi
Endonuklease restriksi tipe II tersebar luas di alam. Sebagian besar enzim ini ditemukan pada bakteri, namun enzim ini juga dapat diisolasi dari
virus, archaea, dan eukariota Anonim
d
, 2006. Keberadaan enzim ini pada organisme merupakan suatu mekanisme pertahanan dari DNA asing. Bagi
bakteri, endonuklease restriksi berfungsi untuk menghancurkan DNA dari sumber-sumber asing, seperti infeksi bakteriofage, dengan cara memotong
DNA asing tersebut pada sekuens yang dikenalinya. Sedangkan sekuens pada genom bakteri yang serupa dilindungi dengan metilasi oleh enzim
metiltransferase. Dengan demikian kemampuan fage untuk tumbuh di dalam sel bakteri dibatasi, meskipun terdapat kemungkinan termetilasinya DNA
asing sebelum dipotong oleh enzim endonuklease restriksi, sehingga DNA tersebut dapat bertahan Alberts et al., 1983.
Pelacakannya pada bakteri berpotensi menghasilkan penemuan enzim endonuklease restriksi. Hal ini didukung dengan kemungkinan terdapatnya
kira-kira satu diantara empat bakteri yang diteliti ternyata memiliki satu jenis atau lebih endonuklease restriksi tipe II. Serta dalam satu spesies dapat
ditemukan hingga 7 macam enzim restriksi Anonim
d
, 2006. Tabel 1 berikut merupakan contoh beberapa enzim endonuklease restriksi, organisme
penghasilnya, dan beberapa karakteristiknya.
Tabel 1. Endonuklease restriksi dari berbagai bakteri Pingoud et al., 1993 Enzim Organisme
penghasil Situs
pemotongan Suhu
optimum pH
optimum Eco
RI Escherichia coli
G ↓AATTC 37
o
C 7,5 Bam
HI Bacillus amyloliquefaciens G
↓GATCC 37
o
C 7,9 Hin
dIII Haemophilus influenzae R
4
A ↓AGCTT 37
o
C 8,0 Hin
fI Haemophilus influenzae R
4
G ↓ACTC 37
o
C 7,4 Pvu
I Proteus vulgaris
CGAT ↓CG 37
o
C 7,4 Pvu
II Proteus vulgaris
CAG ↓CTG 37
o
C 7,5 Pst
I Providencia stuartii
CTGCA ↓G 37
o
C 7,5 Rsa
I Rhodopseudomonas sphaeroides
GT ↓AC 37
o
C 8,0 Rsh
I Rhodopseudomonas sphaeroides
CGAT ↓CG 37
o
C 7,9 Sau
3A Staphylococcus aureus
↓GATC 37
o
C 7,5 Mbo
I Moraxella bovis
↓GATC 37
o
C 7,4 Apa
I Acetobacter pasteurianus
GGGCC ↓C 30
o
C 7,4 Sma
I Serratia marcescens
CCC ↓GGG 25
o
C 8,0 Xma
I Xanthomonas campestris
C ↓GGCCG 25
o
C 7,5 sekuens DNA yang ditunjukkan hanya satu utas dengan arah 5’
→3’ Asal kultur bakteri yang digunakan dalam pelacakan enzim restriksi
sangat beragam. Hingga kini lebih dari 10.000 bakteri dan archaebakteria yang berasal dari kultur koleksi, rumah sakit, tanah, dan air telah di-screening untuk
melacak keberadaan enzim endonuklease restriksi Sharma et al., 2003. Sebagai contoh, Stephens 1981 mengisolasi enzim SciNI dari Spiroplasma
citri yang merupakan patogen tanaman. Sedangkan Yun et al. 1995 melacak
keberadaan enzim restriksi pada mikroba yang tumbuh pada limbah kompos dan melaporkan dihasilkannya enzim SviI dari Streptomyces
violochromogenes D1-5 yang bersifat termostabil.
Welch dan Williams 1995 berhasil mengisolasi enzim restriksi termostabil yang dihasilkan dari genus Thermus, yaitu Tsp4CI dan Tsp8EI
yang diisolasi dari tanah di Islandia. Pada tahun 1996, peneliti yang sama juga berhasil mengisolasi enzim restriksi thermostabil Tsp49I dari Thermus SM49
yang diisolasi dari sumber air panas. Enzim yang bersifat tahan panas tinggi ini merupakan penemuan perangkat molekul yang sangat berarti bagi dunia
pengetahuan, khususnya bagi peneliti di bidang bioteknologi dan biologi molekuler. Enzim restriksi yang diduga merupakan isoschizomer dari PstI
telah berhasil diekstrak oleh Juliana 1996. Enzim tersebut berasal dari
bakteri fotosintetik anoksigenik Rhodobacter sphaeroides MW5 asal pantai Ancol, Jakarta. Karakterisasi enzim tersebut dilakukan oleh Setiawan 1998.
Penelitian dilakukan terus menerus untuk menemukan dan mengembangkan enzim endonuklease restriksi. Dalam penelitian ini,
dilakukan screening terhadap beberapa bakteri, yaitu bakteri hasil isolasi dari tongkol jagung busuk, serta beberapa bakteri dari genus Bacillus B. pumilus
Y1 dan B. licheniformis MB2, Pseudomonas P. syringae dan P. fluorescens
, dan Xanthomonas axonopodis pv. glycines Xag R8, Xag YR58, Xag
YR63, dan Xag YR69. Tongkol jagung adalah tempat pembentukan lembaga dan gudang
penyimpanan makanan untuk pertumbuhan biji serta merupakan modifikasi dari cabang dan mulai berkembang pada ruas-ruas batang. Jagung
mengandung kurang lebih 30 tongkol jagung, sedangkan sisanya adalah kulit dan biji Koswara, 1991. Irawadi 1992 menyatakan bahwa tongkol
jagung mengandung selulosa 40, hemiselulosa 36, lignin 16, serta zat-zat lainnya sebesar 6.
Bacillus sp. merupakan bakteri batang pembentuk spora yang bersifat
aerobik sampai anaerobik fakultatif, katalase positif dan Gram positif. Terdapat beberapa spesies dari genus Bacillus, diantaranya B. subtilis, B.
licheniformis dan B. pumilus Gordon, 1973. B. pumilus Y1 yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan galur lokal dari Bacillus sp. yang diisolasi dari limbah cair tahu oleh Likumahwa 1993. B. pumilus Y1 berbentuk batang
dalam rantai yang panjang streptobacilli. B. licheniformis MB2 merupakan bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber air panas Tompaso, Sulawesi
Utara. Temperatur alami di Tompaso berkisar antara 50-90
o
C dengan pH antara 4,0-6,0. Suhu optimum untuk pertumbuhan B. licheniformis MB2
adalah pada suhu 55
o
C, dengan range suhu pertumbuhan 37-60
o
C. Bakteri ini bersifat anaerob fakultatif.
Pseudomonas adalah salah satu bakteri patogen tanaman yang penting.
Bakteri Gram negatif ini tidak membentuk spora, berbentuk batang, dan obligat aerobik. Spesies Pseudomonas terdiri dari beberapa grup. Salah satu
grupnya mencakup spesies yang menghasilkan pigmen fluoresens
fluorescein seperti P. aeruginosa, P. fluorescens, P. cichorii, dan P. syringae Todar, 2004. Pseudomonas fluorescens adalah bakteri saprofit yang dapat
ditemukan di tanah, air, dan permukaan tanaman. Bakteri ini mudah ditumbuhkan di media yang mengandung senyawa organik, memiliki pH
netral, pada range suhu mesofilik Palleroni, 1984. P. syringae merupakan patogen yang menyerang berbagai tanaman. Beberapa patovar P. syringae
memproduksi fitotoksin, seperti syringotoksin dan syringomicin Todar, 2004.
Xanthomonas campestris merupakan salah satu spesies utama dari
Xanthomonas , yaitu bakteri Gram negatif berbentuk batang yang pada
umumnya merupakan patogen tanaman. Xanthomonas campestris sendiri terbagi atas beberapa patovar, yaitu subgroup berdasarkan kespesifikan
tanaman inang yang terinfeksi asal bakteri tersebut diisolasi Moffet dan Croft, 1983. Xanthomonas campestris pv. glycines dikenal sebagai penyebab
penyakit bisul pada tanaman kedelai. Bakteri dalam spesies ini menghasilkan pigmen lipid terlarut berwarna kuning, yaitu xanthomonadin Palleroni, 1984.
C. Klasifikasi Enzim Endonuklease Restriksi
