Klasifikasi Enzim Endonuklease Restriksi

fluorescein seperti P. aeruginosa, P. fluorescens, P. cichorii, dan P. syringae Todar, 2004. Pseudomonas fluorescens adalah bakteri saprofit yang dapat ditemukan di tanah, air, dan permukaan tanaman. Bakteri ini mudah ditumbuhkan di media yang mengandung senyawa organik, memiliki pH netral, pada range suhu mesofilik Palleroni, 1984. P. syringae merupakan patogen yang menyerang berbagai tanaman. Beberapa patovar P. syringae memproduksi fitotoksin, seperti syringotoksin dan syringomicin Todar, 2004. Xanthomonas campestris merupakan salah satu spesies utama dari Xanthomonas , yaitu bakteri Gram negatif berbentuk batang yang pada umumnya merupakan patogen tanaman. Xanthomonas campestris sendiri terbagi atas beberapa patovar, yaitu subgroup berdasarkan kespesifikan tanaman inang yang terinfeksi asal bakteri tersebut diisolasi Moffet dan Croft, 1983. Xanthomonas campestris pv. glycines dikenal sebagai penyebab penyakit bisul pada tanaman kedelai. Bakteri dalam spesies ini menghasilkan pigmen lipid terlarut berwarna kuning, yaitu xanthomonadin Palleroni, 1984.

C. Klasifikasi Enzim Endonuklease Restriksi

Enzim endonuklease restriksi dibagi menjadi tiga tipe berdasarkan perbedaan dalam komposisi subunit, kofaktor yang diperlukan, dan cara pemotongannya. Terdapat tiga tipe endonuklease restriksi yaitu tipe I EC 3.1.21.3, tipe II EC. 3.1.21.4, dan tipe III EC 3.1.21.5 Pingoud et al., 1993. Perbandingan karakteristik masing-masing tipe enzim tersebut dapat dilihat pada Tabel 2. Endonuklease restriksi tipe I membutuhkan ion Mg dan ATP untuk aktivitas endonuklease dan S-adenosilmetionin SAM untuk aktivitas metilasinya. Enzim ini dikenal akan karakteristik pemotongannya yang acak dan berada di luar situs pengenalannya. Karakteristik ini menyebabkan enzim endonuklease tipe I tidak digunakan secara luas Anonim e , 2006. Hal yang serupa juga dijumpai pada enzim endonuklease tipe III. Enzim ini merupakan kombinasi dari enzim restriksi dan modifikasi, serta memiliki situs pemotongan yang berada di luar situs pemotongannya. Enzim ini membutuhkan dua sekuens yang letaknya berlawanan untuk memberikan hasil pemotongan yang sempurna. Hal ini menyebabkan pemotongan oleh enzim endonuklease restriksi tipe III jarang memberikan hasil pemotongan yang sempurna. Enzim ini tidak digunakan secara luas di laboratorium dan tidak tersedia secara komersial Anonim e , 2006. Tabel 2. Klasifikasi endonuklease restriksi Pingoud et al., 1993 Karakteristik Tipe I Tipe II Tipe III Subunit 3 subunit berbeda 2 subunit sama 2 subunit berbeda Kofaktor Mg 2+ , ATP, S- adenosilmetionin SAM Mg 2+ Mg 2+ , ATP, SAM Posisi pemotongan Acak random, jauh dari situs pengenalan Di dalam situs pengenalan 25 pb dari situs pengenalan Aktivitas Restriksi, modifikasi, topoisomerase, dan ATPase Hanya restriksi Restriksi, modifikasi, dan ATPase Contoh Eco K Eco RI Eco P Sekuen pengenalan AACNNNNGTGC GAATTC AGACC G = Guanin A = Adenin T = Timin C = Cytosin N = Nukleotida tidak spesifik Endonuklease restriksi tipe II adalah enzim yang dapat mengenali sekuens DNA tertentu yang berukuran 4-8 pasang basa bp dan memotong DNA di dalam atau di dekat sekuens pengenalan tersebut Pingoud et al., 1993. Sebagian besar enzim restriksi yang telah diidentifikasi membutuhkan 6 bp Brown, 1990. Pemotongan DNA di dalam atau di dekat situs pengenalan oleh enzim endonuklease restriksi tipe II dapat menghasilkan ujung menggantung sticky end atau ujung tumpul blunt end, yang dapat dilihat pada Gambar 2 berikut ini. Hasil pemotongan yang spesifik ini dimanfaatkan secara luas dalam bidang biologi molekuler, seperti kloning. a. Hasil pemotongan ujung menggantung 5’ b. Hasil pemotongan ujung menggantung 3’ c. Hasil pemotongan ujung tumpul Gambar 2. Berbagai hasil pemotongan dengan enzim restriksi Owen, 1999 Sekuens DNA yang dikenali enzim seringkali berupa sekuens palindromik. Sekuens palindromik merupakan sekuens yang pembacaan dari arah 5’ ke 3’ sama untuk kedua utas DNA. Hal ini berkaitan dengan struktur enzim yang terdiri dari dua subunit yang identik homodimer Pingoud et al., 1993. Bentuk struktur homodimer ini dapat dilihat pada Gambar 3, yaitu enzim PvuI yang memiliki sekuens pengenalan CGATCG. Gambar 3. Struktur enzim PvuI yang mengikat DNA Owen, 1999 Seiring dengan perkembangan teknologi, terutama sekuensing asam amino, klasifikasi enzim ini mengalami perkembangan. Pemetaan sekuens N 5 ↓N 8 GAGN 5 CTCN 13 ↓ ↑N 13 CTCN 5 GAGN 8 ↑N 5 asam amino menunjukkan pada tingkat molekuler, enzim endonuklease restriksi tidak hanya terdiri dari tiga tipe saja. Hal ini menyebabkan berkembangnya klasifikasi modern yang membagi enzim endonuklease restriksi tipe II menjadi delapan subtipe enzim. Perbedaan kedelapan tipe enzim ini terdapat pada karakteristiknya, seperti sekuens pengenalan, subunit, kofaktor, dan posisi pemotongan Pingoud dan Jeltsch, 2001. Enzim yang paling umum dalam tipe II adalah enzim dengan karakteristik yang telah dijelaskan di atas. Sekuens pengenalan enzim bersifat palindromik, subunitnya merupakan homodimer, dan membutuhkan ion Mg 2+ . Posisi pemotongannya tertentu, berada di dalam situs pengenalan, dan memiliki hasil pemotongan berupa ujung menggantung 5’, ujung menggantung 3’, atau ujung tumpul. Enzim tipe ini tersedia secara komersial Anonim e , 2006. Enzim restriksi tipe IIb juga sering disebut tipe IV merupakan enzim restriksi tipe II yang memiliki aktivitas metilasi. Adanya SAM dibutuhkan untuk aktivitas restriksinya. Subunitnya dapat berupa heterotrimer contoh Bcg I ataupun heterodimer BplI. Sekuens pengenalannya dapat berupa sekuens yang simetrik maupun asimetrik. Contoh enzim dengan sekuens simetrik adalah BplI, dengan sekuens pengenalan Pingoud dan Jeltsch, 2001. Kedua utas DNA pada kedua sisi situs pengenalan akan dipotong secara simetris. Letak pemotongannya agak jauh dari situs pengenalan dan selalu menghasilkan ujung menggantung 3’ Anonim g , 2006. Enzim ini berukuran sekitar 850-1250 asam amino. Tipe enzim lain yang menyerupai enzim IIb adalah enzim IIg. Enzim ini juga membutuhkan SAM untuk aktivitasnya. Perbedaannya dengan enzim IIb adalah aktivitas restriksi dan modifikasi enzim ini terletak pada rantai polipeptida tunggal. Contohnya adalah Eco57I. Enzim restriksi tipe II lainnya adalah subtipe IIe. Enzim ini memiliki keunikan pada kebutuhannya akan sebuah situs pengenalan kedua untuk dapat memotong dengan sempurna. Situs pengenalan kedua tersebut berfungsi sebagai efektor alosterik cis atau trans agar enzim dapat mengikat DNA. Sekuens pengenalannya dapat bersifat palindromik ataupun non-palindromik. GGATGN 9 ↓ CCTACN 13 ↓ G ↓CCGGC CGGCC ↑G CC ↓TNAGC GGANT ↑CG Pemotongan dapat terletak di dalam atau di dekat situs pengenalan. Subunit enzim ini dapat berupa homodimer atau monomer. Contohnya adalah enzim Nae I yang memiliki situs pengenalan GCCGGC Anonim g , 2006. Seperti halnya enzim subtipe IIe, enzim IIf membutuhkan dua situs pengenalan untuk memotong. Perbedaannya adalah enzim IIf akan memotong kedua situs tersebut. Enzim IIf merupakan enzim homotetramer. Contohnya adalah NgoMIV yang memiliki sekuens pengenalan Pingoud dan Jeltsch, 2001. Subtipe enzim berikutnya adalah enzim IIt. Enzim ini terdiri dari subunit yang berbeda dan memiliki aktivitas restriksi dan modifikasi. Contohnya adalah enzim Bpu10I dan BslI. Bpu10I mengenali sekuens yang asimetrik, yaitu dan berfungsi sebagai heterodimer dimana kedua subunit diduga memiliki sebuah sisi aktif. Sedangkan BslI mengenali sekuens yang palindromik dan merupakan suatu heterotetramer. Enzim subtipe IIs merupakan enzim restriksi yang berukuran sedang, yaitu 400-650 asam amino. Sekuens pengenalannya bersifat non-palindromik, kontinu, dan asimetrik. Struktur subunitnya berupa suatu monomer yang memiliki dua buah domain, yaitu domain pengikatan DNA dan domain pemotongan DNA. Contohnya adalah enzim FokI dengan sekuens pengenalan Anonim e , 2006; Anonim g , 2006. Subtipe enzim restriksi II yang berbeda dengan yang lainnya adalah subtipe IIm. Keunikannya terletak pada substratnya, dimana enzim ini mengenali DNA yang termetilasi. Aktivitas ini dimiliki oleh enzim BisI yang diteliti oleh Chmusz et al. 2005 dan GlaI yang diteliti oleh Chernukin et al. 2005. Kedua enzim ini memotong sekuens spesifik pada DNA yang termetilasi, yaitu sekuens 5’-G5mc NGC-3’ untuk BisI dan 5’-Gm5C GC- 3’ untuk GlaI. Sebelumnya, tipe enzim yang hanya memotong pada DNA yang termetilasi ini sangat langka. Sejak tahun 1975 hanya satu enzim, yaitu Dpn I, yang dilaporkan memiliki aktivitas demikian. Enzim-enzim yang berkarakteristik unik ini diduga terlibat dalam tahap proteksi sel bakteri terhadap infeksi dari DNA bakteriofage yang termetilasi.

D. Karakteristik Enzim Endonuklease Restriksi