100 mM dengan konsentrasi MgCl
2
yang dibuat bervariasi, yaitu 70 mM, 100 mM, 120 mM, dan 170 mM, serta
β-merkaptoetanol 70 mM. Juga dilakukan penambahan Bovine Serum Albumin BSA dengan konsentrasi 1 mgml.
Untuk melihat pengaruh kekuatan ion digunakan buffer 10 × yang
mengandung Tris-HCl 100 mM, MgCl
2
70 mM, β-merkaptoetanol 70 mM,
dan garam NaCl atau KCl dengan konsentrasi 50 mM atau 100 mM. Bahan-bahan dalam elektroforesis gel agarosa terdiri dari gel loading
buffer , gel agarosa, buffer TAE 10
×, dan ethidium bromida. Komposisi gel loading buffer
dan buffer TAE dapat dilihat pada Lampiran 3.
B. Alat
Alat-alat yang digunakan adalah eppendorf, tips, pipet mikro, sentrifus mikro berpendingin, sonikator Soniprep-150, shaker, neraca analitik, pH
meter, otoklaf, refrigerator, freezer -20
o
C, vorteks, perangkat elektroforesis, UV-transiluminator, pengering vakum, dan alat-alat gelas.
C. Metode Penelitian
1. Isolasi Bakteri dari Tongkol Jagung
Tongkol jagung busuk yang dihancurkan dimasukkan ke dalam air akuades steril. Kemudian 1,0 ml suspensi mikroba diinokulasikan ke media
cair Dung et al. 1993, kemudian diinkubasi dengan shaker. Setelah 24, 36, dan 72 jam dilakukan inokulasi ke media padat dan diinkubasi pada suhu
kamar dan suhu 70
o
C. Setelah tiga hari dipilih koloni yang terpisah dan digoreskan ke media padat yang baru. Seleksi koloni dilakukan secara
bertahap dimana galur-galur yang mampu menghasilkan xylanase menghasilkan zona bening di sekeliling koloni dengan luas lebih dari 3 mm.
Kemudian dipisahkan antara koloni yang membentuk zona bening dan yang tidak membentuk zona bening untuk ditumbuhkan pada media LB cair.
2. Kultivasi Sel
Media LB yang telah diinkubasi selama 48 jam dipindahkan ke dalam eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4
o
C
selama 10 menit. Pelet sel pada bagian bawah tabung dikumpulkan, sedangkan cairan supernatan dibuang.
3. Pemecahan Membran Sel Setiawan, 1998
Pelet sel yang terkumpul disuspensikan dengan buffer sonikasi yang terdiri dari Tris-HCl 10 mM pH 7,5, Na
2
EDTA 1 mM, dan β-merkaptoetanol
7 mM. Suspensi bakteri tersebut disonikasi secara diskontinu, yaitu sonikasi selama 30 detik sebanyak empat kali yang diselingi istirahat selama 2 menit di
antara setiap ulangan dengan amplitudo 15-16 m. Selama sonikasi, tabung yang berisi suspensi bakteri direndam dalam wadah berisi es untuk menjaga
agar suhu suspensi tetap di bawah 10
o
C. Suspensi bakteri yang telah disonikasi dipindahkan ke dalam beberapa
tabung mikro steril dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 30 menit untuk mengendapkan sel-sel debris. Supernatan yang terbentuk mengandung enzim restriksi dan selanjutnya digunakan dalam
proses ekstraksi.
4. Ekstraksi Enzim Restriksi Setiawan, 1998
Ke dalam tabung mikro steril diisikan 255 l akuabides steril, 45 l NaCl 2 M, dan 300 l polimer konsentrat. Tabung mikro yang berisi
campuran tersebut dimasukkan ke dalam wadah yang berisi es agar suhunya menjadi sekitar 4
o
C. Sebanyak 600 l supernatan hasil sentrifugasi ditambahkan ke dalam campuran dan divorteks secara diskontinu, yaitu
divorteks selama 1-2 detik sebanyak 10 kali. Di antara setiap ulangan, tabung dimasukkan ke dalam es, sehingga suhunya dapat dipertahankan sekitar 4
o
C. Selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu
4
o
C selama 15 menit untuk mengendapkan asam nukleat. Enzim restriksi yang diinginkan berada pada bagian supernatan.
Ekstraksi diulangi lagi dengan cara menambahkan 300 l polimer konsentrat ke dalam tabung mikro steril dan dimasukkan ke dalam es.
Sebanyak 900 l cairan supernatan hasil sentrifugasi pada ekstraksi tahap pertama ditambahkan ke dalam tabung mikro tersebut. Campuran divorteks
secara diskontinu dan disentrifugasi pada kondisi yang sama dengan ekstraksi tahap pertama. Tahap ekstraksi dengan polimer konsentrat dapat diulangi
dengan cara yang sama. Enzim restriksi pada bagian supernatan selanjutnya dapat diuji aktivitasnya.
5. Isolasi plasmid Sambrook et al., 1989
