tinggi di atas 8,5, substitusi ion Mg
2+
dengan kation divalen lainnya, waktu inkubasi yang terlalu lama atau jumlah enzim yang terlalu banyak, konsentrasi
gliserol yang terlalu tinggi, dan adanya pelarut organik etanol, dimetilsulfoksida Anonim
b
, 2006. Menurut Davis et al. 1986, faktor-faktor lain yang berhubungan
dengan kondisi-kondisi reaksi seperti kemurnian DNA dan keadaan enzim itu sendiri juga mempengaruhi aktivitasnya. Metilasi DNA, ikatan dengan protein
atau kekentalan yang berlebihan dari DNA berberat molekul tinggi dalam larutan yang pekat dapat menurunkan efisiensi pemotongan oleh enzim. Pada
umumnya DNA yang akan dipotong harus bebas dari pengotor. Adanya RNA dan DNA utas tunggal tidak berpengaruh buruk terhadap aktivitas sebagian
enzim restriksi.
E. Deteksi Aktivitas Enzim Endonuklease Restriksi
1. Digesti
Kemampuan enzim endonuklease restriksi untuk mengenali dan memotong pada situs tertentu dapat dibuktikan dengan mereaksikannya
dengan substrat DNA digesti. Substrat DNA tersebut akan mengalami pemotongan bila terdapat sekuens yang sesuai dengan sekuens spesifik
enzim restriksi. Pemotongan akan menyebabkan terbentuknya fragmen- fragmen DNA yang berukuran lebih kecil. Pengujian aktivitas ekstrak
enzim dilakukan dengan mereaksikannya dengan dua macam substrat DNA, yaitu DNA plasmid dan DNA fage lambda, dalam kondisi reaksi
yang dioptimalkan dengan buffer reaksi. a. Plasmid sebagai substrat
DNA plasmid adalah DNA sirkuler berutas ganda yang terdapat dalam suatu bakteri sebagai DNA ekstrakromosomal yang
independen dan dapat bereplikasi sendiri Glick dan Pasternak, 2003. Ukuran plasmid beragam dari kurang dari 1 kpb hingga lebih dari 500
kpb. Plasmid memiliki beberapa fenotipe, yaitu resisten terhadap antibiotik tertentu, produksi antibiotik, degradasi senyawa organik
kompleks, produksi kolisin dan enterotoksin, dan modifikasi atau restriksi oleh enzim Old dan Primrose, 1989.
Plasmid dapat dipotong oleh enzim restriksi karena adanya bermacam situs pengenalan dalam suatu plasmid. Dalam
perkembangannya, plasmid direkayasa secara genetik agar memiliki berbagai situs pengenalan oleh enzim restriksi untuk menfasilitasi
kebutuhan kloning Brown, 1990. Terdapatnya berbagai situs pengenalan dalam plasmid dapat digunakan untuk mendeteksi
aktivitas pemotongan dari ekstrak enzim restriksi. Umumnya plasmid berbentuk molekul DNA sirkuler berutas
ganda. Apabila kedua utas berupa lingkaran utuh, molekulnya digambarkan sebagai CCC Covalently Closed Circular DNA yang
berarti lingkaran tertutup kovalen. Apabila hanya satu utas yang utuh molekulnya digambarkan sebagai OC DNA atau lingkaran terbuka
Open Circular. Ketika diisolasi dari sel, CCC memiliki defisiensi lengkungan pada heliks rangkap, sehingga terbentuk konfigurasi
kumparan terpilin superkoil Old dan Primrose, 1989. Perbedaan konfigurasi struktural menyebabkan DNA superkoil
dan OC DNA terpisah pada elektroforesis dengan gel agarosa. Bentuk DNA superkoil memiliki pergerakan yang tercepat. Plasmid yang
mempunyai satu situs pemotongan akan mengalami perubahan bentuk menjadi linier jika terpotong. Jika pemotongan berjalan
kurang sempurna, dapat pula dihasilkan bentuk OC yang menyertai bentuk linier Roberts dan Halford, 1993. Pada hasil elektroforesis,
plasmid OC memiliki pergerakan yang lebih lambat dibandingkan plasmid linier, sehingga bila ketiga konfigurasi plasmid
dielektroforesis bersama, plasmid superkoil memiliki pergerakan tercepat, diikuti plasmid linier dan plasmid OC Brown, 1990.
b. DNA fage lambda sebagai substrat DNA fage lambda merupakan salah satu DNA yang paling
banyak digunakan sebagai vektor dalam kloning karena sekuensnya
yang tidak analog dengan DNA kromosomal. DNA ini memiliki banyak situs yang dapat dikenali dan dipotong oleh banyak enzim
restriksi seperti terlihat pada Gambar 4. Enzim-enzim tersebut dapat memotong DNA fage lambda pada satu situs atau lebih, sehingga
terbentuk beberapa potongan fragmen DNA. Ukuran DNA fage lambda cukup besar, yaitu 48.502 pb. Ujung-ujung utas ganda
liniernya merupakan ujung menggantung 5’ sebanyak 12 pb yang bersifat komplementer Old dan Primrose, 1989.
Gambar 4. Peta restriksi DNA fage lambda Anonim
c
, 2006
2. Elektroforesis Agarosa
