Elektroforesis Gel Agarosa Suwanto, 1993

6. Digesti dengan Ekstrak Enzim Endonuklease Restriksi

Digesti DNA plasmid dilakukan dengan mereaksikan 15 l ekstrak enzim dengan 5 l substrat DNA dan 2 l buffer reaksi 10 ×. Reaksi dilakukan selama semalam pada suhu 37 o C. Sebagai pembanding digunakan plasmid utuh yang tidak direaksikan dengan ekstrak enzim. Digesti DNA fage lambda dilakukan dengan cara yang sama, namun dalam jumlah yang berbeda, yaitu 4 l DNA fage lambda, 16 l ekstrak enzim dan 2 l buffer reaksi 10 ×.

7. Elektroforesis Gel Agarosa Suwanto, 1993

Aktivitas pemotongan oleh enzim restriksi dihentikan dengan cara memindahkan campuran enzim restriksi-substrat-buffer ke dalam freezer. Hasil reaksi diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1 atau 0,8. Sebanyak 0,25 g agarosa dicampur dengan 25 ml buffer TAE 1 × untuk membuat gel kecil 1 atau 0,4 g agarosa dengan 40 ml buffer TAE 1 × untuk membuat gel besar. Campuran agarosa dan buffer TAE dipanaskan hingga mendidih dan didinginkan sampai suhu 55-60 o C, kemudian dituang ke dalam cetakan yang telah diberi sisir. Setelah gel membeku, sisirnya diambil dan gel diletakkan dalam wadah elektroforesis. Wadah elektroforesis diisi dengan buffer TAE 1 × sampai gel berada sekitar 1 mm di bawah permukaan cairan buffer. Sampel yang akan dianalisis ditambah dengan 1,5 l blue juice. Sebanyak 20 l sampel dimasukkan ke dalam sumur gel. Untuk menentukan ukuran fragmen, sebanyak 3 l marker DNA 1 kb juga dimasukkan ke dalam salah satu sumur gel. Pelindung ditutup dan alat elektroforesis dijalankan pada arus 110 mA, tegangan 50 V selama 75-90 menit untuk gel kecil. Setelah proses elektroforesis selesai, gel direndam dalam larutan ethidium bromida selama 15-20 menit untuk proses staining. Proses destaining dilakukan dengan cara merendam gel dalam akuades selama 10-15 menit. Pita-pita DNA yang terbentuk diamati dengan UV-transilluminator. Untuk keperluan dokumentasi, gel difoto dengan kamera digital. IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Screening Bakteri dari Isolat Tongkol Jagung Media yang digunakan dalam screening adalah komposisi media oleh Dung et al. 1993. Media oleh Dung et al. terdiri dari beberapa macam garam, ekstrak khamir, dan oat spelt xylan. Oat spelt xylan merupakan sumber karbon dalam bentuk xylan. Xylan memberikan kekeruhan pada media padat, sehingga bila xylan dimanfaatkan bakteri sebagai sumber karbonnya, aktivitas ini akan terdeteksi dengan adanya zona bening. Bakteri penghasil enzim xylanase didapatkan dengan mengambil koloni terpisah yang dikelilingi zona bening dengan luas lebih dari 3 mm. Sampel screening adalah tongkol jagung busuk. Xylan merupakan salah satu komponen yang terkandung dalam tongkol jagung, sehingga screening terhadap mikroorganisme pembusuknya berpotensi untuk mendapatkan bakteri memiliki aktivitas xylanolitik. Metode pengambilan sampel adalah metode pencelupan dipping method. Permukaan tongkol jagung busuk tidak rata, sehingga pengambilan sampel dengan metode swab sulit untuk mendapatkan sampel yang representatif. Tekstur tongkol jagung juga masih terlalu keras untuk dihancurkan, sehingga untuk mendapatkan sampel yang mewakili, metode pencelupan dianggap paling sesuai. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C dan 70 o C. Inkubasi pada suhu 37 o C bertujuan untuk mendapatkan bakteri mesofilik, sedangkan inkubasi pada suhu 70 o C bertujuan untuk mendapatkan bakteri termofilik. Namun dari inkubasi pada suhu 70 o C ini tidak terdapat bakteri yang tumbuh, sehingga keseluruhan isolat bakteri yang diperoleh merupakan bakteri mesofilik. Hal ini mungkin disebabkan pembusukan tongkol jagung yang dilakukan pada suhu ruang, sehingga tidak menunjang pertumbuhan bakteri termofilik. Screening terhadap bakteri termofilik dilakukan karena bakteri termofilik dapat menghasilkan enzim restriksi termostabil. Menurut Sharma et al . 2003, enzim restriksi termostabil memiliki beberapa keuntungan, yaitu stabilitas termal yang lebih baik, stabilitas saat pembekuan-thawing yang lebih baik, dan hasil purifikasi yang lebih banyak karena stabilitas termal yang lebih baik. Screening menghasilkan 16 koloni terpisah, yaitu 12 koloni penghasil enzim xylanase dan 4 koloni yang tidak dapat menghasilkan xylanase. Dari 16 koloni terpisah, dipilih 8 penghasil xylanase, yaitu MBXi P1, MBXi P2, MBXi P3, MBXi K1, MBXi K2, MBXi K7, MBXi K8, dan MBXi K9; dan 2 yang tidak menghasilkan xylanase, yaitu 7B dan A, untuk diujikan aktivitas enzim endonuklease restriksinya. Pada pembahasan selanjutnya ekstrak enzim restriksi dari isolat bakteri MBXi P1 akan disebut ekstrak enzim P1 dan begitu pula dengan ekstrak enzim dari isolat lainnya. Bakteri-bakteri hasil isolasi tongkol jagung busuk tersebut diharapkan dapat menghasilkan enzim endonuklease restriksi yang spesifik karena penelitian Yun et al. 1995 menunjukkan bakteri yang diisolasi dari limbah, yaitu limbah kompos, dapat menghasilkan enzim endonuklease restriksi spesifik SviI. Selain 10 isolat bakteri tongkol jagung, akan diujikan pula beberapa koleksi kultur dari Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Riset Biologi dan Bioteknologi, yaitu Bacillus pumilus Y1, B. licheniformis MB2, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, dan empat macam strain dari Xanthomonas axonopodis campestris pv. glycines Xag. Bacillus pumilus Y1 dipilih untuk mewakili sampel yang berasal dari limbah karena diisolasi dari limbah tahu cair, sedangkan B. licheniformis MB2 sebagai sampel yang diisolasi dari sumber air panas. P. syringae, P. fluorescens, dan beberapa strain dari Xanthomonas axonopodis campestris pv. glycines yang merupakan patogen tanaman juga diharapkan dapat menghasilkan enzim endonuklease restriksi spesifik. Dengan keberadaannya sebagai patogen diperkirakan bakteri tersebut memiliki pertahanan yang baik terhadap DNA asing yang dapat menginfeksi, sehingga mungkin terdapat endonuklease spesifik sebagai bentuk pertahanan terhadap DNA asing tersebut. Hal ini juga didukung dengan adanya penelitian yang menunjukkan dihasilkannya enzim endonuklease spesifik dari bakteri patogen tanaman, seperti SciNI dari Spiroplasma citri , bakteri patogen tanaman jeruk Stephens, 1982. Penumbuhan isolat dilakukan selama 48-72 jam pada media cair LB. Bakteri pada umumnya dipanen pada saat pertumbuhannya mencapai fase logaritmik. Endow dan Roberts 1977 melakukan kultivasi sel saat Xanthomonas malvacearum memasuki fase logaritmik akhir untuk mendapatkan XmaI dan XmaII. Namun menurut Pirrota dan Bickle 1990, jumlah enzim restriksi yang dihasilkan per sel bakteri tidak banyak berbeda selama siklus pertumbuhannya. Bakteri dapat ditumbuhkan sampai mencapai fase stationer sebelum dipanen. Hal ini dilakukan pada banyak penelitian, seperti pada purifikasi parsial enzim MboI dan MboII Gelinas et al., 1977 dan enzim HhaI Roberts et al., 1976. Hal ini menguntungkan karena pertumbuhan kultur bakteri tidak perlu dimonitor secara teliti.

B. Ekstraksi Enzim Endonuklease Restriksi