menggunakan waterbath. Ditambahkan 25 mL akuades panas, dicampur secara merata. Dibiarkan hingga dingin pada suhu kamar. Ditambahkan 3-4 tetes larutan
NaCl 10 . Kemudian ekstrak disaring dengan menggunakan vacuum. Filtrat dibagi ke dalam 4 tabung masing- masing 3 mL. Pada tabung I ditambahkan 4-5
tetes larutan gelatin 1 . Pada tabung II ditambahkan 4-5 tetes pereaksi garam gelatin gelatin 1 ditambahkan NaCl 10 . Pada tabung III ditambahkan 3-4
tetes ferri klorida. Tabung IV dijadikan kontrol dan tidak ditambahkan pereaksi apapun. Diamati warna yang terbentuk pada setiap tabung.
3. Isolasi crude phlorotannin
Serbuk alga ditimbang sebanyak 80 g. Kemudian serbuk dimasukkan ke dalam
kertas filter Schleicher Schuell
dan dimasukkan dalam labu soxhlet. Setelah itu diberi pelarut metanol sebanyak 2 kali sirkulasi. Proses soxhletasi
dilakukan sampai tetesan pelarut jernih dengan suhu ± 120º C. Hasil soxhletasi diuapkan pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai
volume yang kecil 110 dari volume mula-mula. Selanjutnya ditambahkan 60 mL metanol, 120 mL kloroform, dan 45 mL air kemudian digojog dan didiamkan
hingga membentuk dua lapisan. Dipisahkan antara lapisan atas dan lapisan bawah, selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat dua kali masing-
masing 75 mL. Fraksi etil asetat dikumpulkan, selanjutnya diuapkan, dan diperoleh ekstrak yang merupakan crude phlorotannin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin Ciocalteau a. Pembuatan larutan standar
Standar phloroglucinol ditimbang seksama lebih kurang 0,05 g, kemudian dilarutkan dalam aseton 75 sampai volume 50,0 mL. Seri konsentrasi larutan
intermediet dipipet dari larutan induk sebanyak 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4;0; 5,0; dan 6,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dilarutkan dengan aseton 75,
sehingga konsentrasinya menjadi 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4;0; 5,0; dan 6,0 ppm.
b. Penentuan operating time OT
Larutan intermediet 4,0 ppm dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin
Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Campuran didiamkan selama 2 menit lalu ditambahkan 7,5 mL Na
2
CO
3
1,9 M, dan ditambah akuades sampai volume 50,0 mL. Absorbansi diukur setiap 2 menit pada panjang
gelombang teoritis phloroglucinol 750 nm selama 90 menit.
c. Penentuan panjang gelombang maksimum ?
maks
Larutan intermediet phloroglucinol dengan konsentrasi 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang
mengand ung 2,5 mL pereaksi fenol Folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Campuran didiamkan selama 2 menit, lalu ditambah 7,5
mL Na
2
CO
3
1,9 M, dan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama OT. Pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
campuran divortex selama 30 detik, kemudian campuran hasil reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan diukur serapannya pada
operating time pada rentang panjang gelombang 400 – 900 nm. Panjang gelombang maksimum ditentukan dari spektrogram yang didapatkan.
5. Penetapan kurva baku phloroglucinol
Larutan intermediet dipipet masing-masing sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-
Ciocalteau yang diencerkan 1:1, biarkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na
2
CO
3
1,9 M dan dicampur dengan akuades sampai 50,0 mL. Campuran divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian
disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm dan diambil supernatannya.
Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum hasil scanning 750,1 nm. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. Dihitung data yang didapat dengan
program regresi linier sehingga didapatkan persamaan kurva baku.
6. Estimasi kadar polifenol total pada sampel fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh
Lebih kurang 0,05 g fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh ditimbang dengan seksama, kemudian dilarutkan dalam aseton 75
hingga volumenya 50,0 mL. Diambil 10,0 mL larutan sampel alga coklat dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi
fenol Folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Campuran didiamkan selama 2 menit kemudian ditambahkan 7,5 mL Na
2
CO
3
1,9 M dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada temperatur ruang selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru
pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik. Kemudian, campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm
selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum menggunakan spektrofotometer visibel.
Absorbansi dimasukkan ke persamaan kurva baku.
Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan phloroglucinol mg PGE g fraksi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum cymosum C. Agardh
Pengambilan simplisia dilakukan di Pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta. Simplisia alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh diperoleh dari
petani alga pada tanggal 23 Maret 2007 pada pukul 16.00 – 17.00 WIB. Menurut petani, saat pengambilan simplisia temperatur air sekitar 27º-30º C, cuaca
mendung dan gerimis. Hal tersebut perlu diketahui sebab menurut Yates dan Peckol 1993 parameter lingkungan seperti salinitas, ketersediaan nutrisi dan
cahaya, irradiasi UV, dan intensitas herbivora dapat mempengaruhi kadar phlorotannin
cit., Koivikko, 2005. Selanjutnya simplisia alga coklat yang didapat diidentifikasi dengan
bantuan dari Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta. Dengan kesimpulan bahwa simplisia alga coklat termasuk dalam
ordo Fucales, familia Sargassaceae, genus Sargassum, spesies Sargassum cymosum
C. Agardh. lihat lampiran 1. Simplisia Alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh dicuci dengan air
mengalir untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang berupa epifit, pasir silikat, dan benda-benda asing yang ikut terbawa saat proses pengambilan
simplisia. Pengotor-pengotor harus dihilangkan sebab dapat mengganggu hasil analisis. Senyawa silikat dapat membentuk kompleks molibdat yang berupa
H
6
[SiMo
12
O
40
].n H
2
O dari reagen Folin Ciocalteau dalam suasana asam sehingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
