Alat-Alat Bahan-Bahan Hewan Percobaan Analisis Data

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, penyiapan hewan uji, dan pengolahan data. Data dianalisis secara ANOVA analisis variansi dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey menggunakan program SPSS statistical product and service solution versi 18.

3.1 Alat-Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, neraca kasar ohaus, neraca digital vibra, stopwatch, mortir dan stamfer, neraca hewan presica, spuit ukuran 1 ml, alat bedah wells spencer, mikroskop boeco, BM-180, halogen lamp, sentrifugator dynamica, velocity 18R, politube, mikrotube, kamera digitalMDCE-5A.

3.2 Bahan-Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah MSG, makanan hewan berupa pelet, metanol, larutan giemsa, minyak emersi, NaCl 0,9, serum darah sapi SDS dan siklofosfamid Cyclovid ® , Novell.

3.3 Hewan Percobaan

Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit jantan dan betina berumur 2-3 bulan dengan berat badan 18-30 g sebanyak 30 ekor. Sebelum penelitian dimulai, terlebih dahulu mencit dipelihara selama kurang lebih satu minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan lingkungannya.

3.4 Pengujian Efek Mutagenik

Universitas Sumatera Utara Pengujian efek mutagenik meliputi penyiapan hewan penelitian, penyiapan makanan hewan, penyiapan larutan siklofosfamid LS, penyiapan serum darah sapi SDS, pengujian pada mencit, pembuatan preparat apusan sumsum tulang femur dan pengamatan apusan pada mikroskop.

3.4.1 Penyiapan hewan percobaan

Hewan yang digunakan adalah mencit dengan berat 18-30 g sebanyak 30 ekor dibagi 5 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 6 ekor mencit. Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk menyesuaikan lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya.

3.4.2 Penentuan dosis MSG yang digunakan

LD 50 MSG = 16.600 mg = 16.6 g Untuk dosis yang digunakan pada mencit adalah 16 dari LD 50 , yaitu: 16 x 16,6 g = 2,76 g ≈ 3 g Setelah didapat 16 dari LD 50 yaitu 3 g, kemudian di beri dosis kelipatan menjadi 3 g, 6 g, dan 9 g Wikipedia, 2012.

3.4.3 Pembuatan amylum 5

Amylum sebanyak 5 g dicampurkan pada lumpang yang berisi air panas, aduk homogen sampai terbentuk massa yang jernih, kemudian tambahkan aquadest sampai dengan 100 ml. Universitas Sumatera Utara

3.4.4 Penyiapan makanan hewan

Formula pembuatan makanan mencit: MSG 3 g 6 g 9 g Amylum 0,1 0,1 0,1 Nipagin 0,1 g 0,1 g 0,1 g Pelet ad 10 g ad 10 g ad 10 g Pembuatan makanan hewan dilakukan dengan cara sebagai berikut: MSG digerus ke dalam lumpang, ditambahkan nipagin 0,1 g dan amylum. Amylum yang diambil adalah 0,1 yaitu sebanyak 2 ml dari pembuatan amylum 5, lalu digerus sampai homogen, kemudian ditambahkan pelet sampai dengan 10 g, gerus sampai homogen, lalu cetak menjadi pelet baru yang mengandung MSG. 3.4.5 Penyiapan larutan siklofosfamid LS 0,5 bv Pembuatan LSdilakukan dengan cara sebagai berikut: ditimbang sebanyak 25 mg siklofosfamid serbuk kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 ml, ditambahkan larutan fisiologis [NaCl 0,9 bv] sampai batas tanda.

3.4.6 Pembuatan serum darah sapi SDS

Serum diperoleh dari darah sapi segar. Darah ditampung langsung menggunakan vakum tube saat penyembelihan hewan. Vakum tube ditutup dan didiamkan lebih kurang 30 menit, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 15 menit. Diambil cairan yang berwarna bening kekuning-kuningan bagian atas yang merupakan serumnya.

3.4.7 Pengujian efek mutagenik pada mencit penelitian

Universitas Sumatera Utara Pengujian efek mutagenik dilakukan dengan cara uji mikronukleus dengan modifikasi.Hewan penelitian dikelompokkan menjadi 5 kelompok, masing- masing terdiri dari 6 ekor hewan percobaan. Kelompok tersebut adalah: - Kelompok I : Kontrol normal, diberikan pelet secara per oral l0 ghari, selama 14 hari. - Kelompok II : Perlakuan, diberikan pelet 7 ghari yang dicampurkan dengan MSG 3 ghari selama 14 hari. - Kelompok III : Perlakuan, diberikan pelet 4 ghari yang dicampurkan dengan MSG 6 ghari selama 14 hari. - Kelompok IV : Perlakuan, diberikan pelet 1 ghari yang dicampurkan dengan MSG 9 ghari selama 14 hari. - - Kelompok V : Pembanding, diberikan pelet 10 ghari selama 14 hari, dan pada hari ke-15 di induksi dengan LS 50 mgkgBB secara i.p. - Setelah 30 jam pemberian siklofosfamid, semua mencit penelitian dibunuh dengan cara dislokasi leher dan diambil sumsum tulang femurnya dengan cara diaspirasi menggunakan spuit yang berisi SDS sebanyak 0,3 ml dan ditampung di dalam mikrotube Khrisna dan Hayashi, 2000; Purwadiwarsa, dkk., 2000; Khumphant, dkk., 2002.

3.4.8 Pembuatan preparat apusan sumsum tulang femur

Campuran sumsum tulang dan SDS dalam mikrotub diputar disintrifuge dengan kecepatan 1200 rpm selama 5 menit, kemudian supernatannya dibuang. Endapannya disuspensikan kembali dengan dua tetes SDS, kemudian satu tetes suspensi sel diambil dan diletakkan ke atas objek glass, dengan menggunakan objek glass yang lain, sel dihapuskan menjadi preparat apusan. Kemudian slide dikeringkan, difiksasi dengan metanol selama 10 menit. Kemudian diberikan pewarna giemsa dibiarkan 30 menit, dibuang zat warna dengan dibilas dengan air Universitas Sumatera Utara yang mengalir kemudian apusan dikeringkan Khrisna dan Hayashi, 2000; Sofyan, 2005.

3.4.9 Pengamatan apusan

Data pengamatan masing-masing hewan harus dipresentasikan dalam bentuk tabel. Jumlah eritrosit polikromatik bermikronukleus maupun tidak bermikronukleus dihitung paling tidak sebanyak 200 sel EPA, 1998. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10×100 dengan bantuan minyak immersi Khrisna dan Hayashi, 2000.

3.5 Analisis Data

Data hasil penellitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 18. Data hasil penelitian ditentukan homogenitas dan normalitasnya untuk menentukan analisis statistik yang digunakan. Data dianalisis dengan menggunakan uji ANOVA satu arah dengan nilai signifikansi, p0,05 dianggap signifikan. Kemudian dilakukan uji lanjutan Post Hoc Tukey untuk mengetahui melihat perbedaan jumlah rata-rata kritis mikronukleus antar kelompok perlakuan. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengujian Efek Mutagenik

Gambar pengamatan sel pada apusan sumsum tulang femur mencit pada mikroskop cahaya dengan pewarna giemsa dan perbesaran 400x dapat dilihat pada Gambar 4.1 berikut ini. A B C D Gambar 4.1 Sel-sel yang diamati pada apusan sumsum tulang femur mencit Keterangan gambar: A : Sel eritrosit polikromatik bermikronukleus MSG 3 g B : Sel eritrosit polikromatik bermikronukleus MSG 6 g C : Sel eritrosit polikromatik bermikronukleus MSG 9 g D : Sel eritrosit polikromatik tidak bermikronukleus Secara teoritis mikronukleus merupakan kromatin sitoplasmik yang tampak sebagai inti kecil terbentuk dari patahan kromosom yang diasingkan dari inti nukleus pada tahap anafase pembelahan sel. Setelah mencapai tahap Universitas Sumatera Utara