1. Konfirmasi Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum dilakukan penelitian, kultur bakteri asam laktat dikonfirmasi
terlebih dahulu untuk mengetahui sifat-sifat dan jenis kultur bakteri asam laktat yang digunakan. Konfirmasi meliputi ciri-ciri morfologi kultur yang diuji dengan
pewarnaan gram selain itu sifat-sifat fisiologis kultur juga ditentukan yang meliputi: kemampuan menghidrolisis H
2
O
2
dengan uji katalase, kemampuan tumbuh pada suhu yang berbeda 10
o
C, 15
o
C, 37
o
C dan 45
o
C, kemampuan tumbuh pada konsentrasi garam yang berbeda 4 dan 6,5, kemampuan
tumbuh pada pH yang berbeda 4,4 dan 9,6, kemampuan memproduksi gas CO
2
dari glukosa, kemampuan menghasilkan dekstran dari sukrosa dan kemampuan menghasilkan amonia dari arginin.
Sifat-sifat bakteri asam laktat ditentukan dengan menginokulasikan masing-masing kultur yang berumur 24 jam pada media MRSB, MRSB yang
telah diatur pHnya, MRSB yang ditambah dengan NaCl sesuai perlakuan, Media Gibson’s semisolid tomato juice, Media Sukrosa Agar, MRSB yang ditambah
dengan L-Arginin Monohydrat. Selanjutnya kultur diinkubasikan pada suhu 37
o
C sesuai perlakuan untuk uji kemampuan tumbuh pada suhu yang berbeda selama
24 jam. Pengujian dinyatakan positif jika terjadi pertumbuhan bakteri asam laktat pada medium yang ditandai dengan munculnya kekeruhan pada medium.
2. Penentuan Kurva Pertumbuhan Kultur Bakteri Asam Laktat Harmayani et al. 2001 yang dimodifikasi
Sebelum dilakukan pembuatan biomassa sel, maka harus diketahui terlebih dahulu bagaimana kurva pertumbuhan kultur bakteri asam laktat yang digunakan.
Hal ini bertujuan untuk mengetahui produksi biomassa sel yang paling optimal terjadi pada waktu tertentu. Kurva pertumbuhan dibuat dengan cara
menginokulasikan masing - masing kultur yang berumur 24 jam pada media MRSB dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Pada awal inkubasi jam ke-0 dan setiap 1 jam dilakukan pengukuran jumlah bakteri dengan
menggunakan spektrofotometer pada 600 nm. Diagram alir proses penentuan kurva pertumbuhan bakteri asam laktat dapat dilihat pada Gambar 3.
3. Pembuatan Kultur Kering dengan Pengeringan Beku Nuraida et al. 1995; Harmayani et al. 2001; Champagne et al. 2001 yang dimodifikasi
Sebelum proses pengeringan beku dilakukan produksi biomassa sel bakteri asam laktat Harmayani et al. 2001 yang dimodifikasi. Biomassa bakteri asam
laktat dibuat dengan menggunakan media MRSB. Pada medium yang telah steril diinokulasi kultur bakteri asam laktat yang telah disegarkan sebanyak 10
kemudian diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 16 - 20 jam. Kultur kerja selanjutnya dipanen dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10
menit. Supernatan dipisahkan dengan bagian filtrat sehingga diperoleh biomassa basah. Diagram alir proses pembuatan biomassa dapat dilihat pada Gambar 4.
Kultur stok dari manik-manik
3-5 manik-manik diinokulasikan dalam 9 ml MRS Broth
Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C
Inokulasi kembali kultur ke dalam media MRS Broth dan inkubasi pada suhu 37
o
C
Jumlah bakteri dihitung setiap 1 jam dengan melihat tingkat kekeruhannya dengan
spektrofotometer pada 600 nm
Buat kurva pertumbuhan
Gambar 3. Diagram alir penentuan kurva pertumbuhan bakteri asam laktat Kurva petumbuhan bakteri asam laktat
Pada proses pengeringan beku dilakukan penambahan bahan pelindung kriogenik berupa laktosa, sukrosa, susu skim dan maltodekstrin dengan
konsentrasi 10 bv pada biomassa basah bakteri asam laktat. Perbandingan antara biomassa basah dengan bahan pelindung kriogenik adalah 1 : 10. Untuk
memungkinkan difusi dari bahan pelindung kriogenik maka larutan disimpan selama 1 jam pada suhu 23
o
C. Kultur selanjutnya dibekukan pada suhu -80
o
C selama 12 jam dan kemudian dikeringkan drying dengan pengering beku merk
Labconco pada kondisi -50
o
C; 0,01 Mpa selama 2 hari. Kultur bakteri asam laktat kering yang diperoleh selanjutnya diuji viabilitasnya selama pengeringan beku,
ketahanan terhadap pH rendah, ketahanan terhadap garam empedu dan perkiraan
jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon secara metaanalisis.
4. Penyimpanan Kultur Kering Bakteri Asam Laktat
