Pada proses pengeringan beku dilakukan penambahan bahan pelindung kriogenik berupa laktosa, sukrosa, susu skim dan maltodekstrin dengan
konsentrasi 10 bv pada biomassa basah bakteri asam laktat. Perbandingan antara biomassa basah dengan bahan pelindung kriogenik adalah 1 : 10. Untuk
memungkinkan difusi dari bahan pelindung kriogenik maka larutan disimpan selama 1 jam pada suhu 23
o
C. Kultur selanjutnya dibekukan pada suhu -80
o
C selama 12 jam dan kemudian dikeringkan drying dengan pengering beku merk
Labconco pada kondisi -50
o
C; 0,01 Mpa selama 2 hari. Kultur bakteri asam laktat kering yang diperoleh selanjutnya diuji viabilitasnya selama pengeringan beku,
ketahanan terhadap pH rendah, ketahanan terhadap garam empedu dan perkiraan
jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon secara metaanalisis.
4. Penyimpanan Kultur Kering Bakteri Asam Laktat
Kultur kering bakteri asam laktat yang menunjukkan hasil terbaik pada penelitian tahap 1 dipilih untuk digunakan pada tahap 2 yaitu penyimpanan kultur
kering. Proses penyimpanan dilakukan dengan mengulangi dari proses awal produksi biomassa sel, pengeringan kultur bakteri asam laktat terpilih dan
selanjutnya menyimpan pada desikator yang telah diatur kelembabannya dengan Medium MRS broth
Sterilisasi pada suhu 121
o
C selama 15 menit
Inokulasi dengan isolat bakteri asam laktat sebanyak 10
Inkubasi pada suhu 37
o
C selama 16 - 20 jam
Sentrifuse 10000 rpm selama 10 menit
Biomassa basah Gambar 4. Diagram alir pembuatan biomassa
menggunakan larutan garam jenuh. Kondisi penyimpanan yang digunakan adalah pada suhu ruang dengan tingkat kelembaban 75 dan 89. Proses penyimpanan
dilakukan sampai produk kultur kering bakteri asam laktat mengalami kerusakan yang ditandai dengan penurunan viabilitas sel. Pengujian kultur kering dilakukan
setiap 2 hari hari ke- 0, 1 ,3 ,5 dan 7 meliputi: viabilitas bakteri asam laktat, total kapang dan khamir, kadar air, Aktivitas air a
w
dan Aktivitas asidifikasi kultur kering meliputi total asam tertitrasi dan pH susu skim yang diasamkan.
5. Pendugaan Umur Simpan Kultur Kering Bakteri Asam Laktat Labuza 1982
Pendugaan umur simpan kultur kering bakteri asam laktat terpilih dilakukan dengan menggunakan pendekatan kurva sorpsi isotermis. Parameter
kritis yang digunakan untuk menduga umur simpan adalah viabilitas bakteri asam laktat, kadar air dan Aktivitas air a
w
kultur kering bakteri asam laktat selama penyimpanan. Umur simpan berdasarkan pendekatan kurva sorpsi isotermis dapat
dihitung dengan menggunakan persamaan Labuza persamaan 1.
Metode Analisis 1. Pengamatan Morfologis dengan Pewarnaan Gram Hadioetomo 1993
Sebanyak 1 lup penuh air steril diletakkan pada kaca obyek kemudian dengan jarum ose steril dipindahkan sedikit isolat keatasnya selanjutnya
dicampurkan dan disebarkan hingga merata dan dibiarkan mengering. Kaca obyek dilewatkan di atas api bunsen, dimana kaca obyek harus terasa agak panas bila
ditempelkan pada punggung tangan atau sekali-kali dikeringanginkan di udara hingga terbentuk lapisan kultur yang tipis dan merata.
Pewarnaan Gram di mulai dengan meneteskan pewarna primer kristal violet secara merata di atas kultur pada kaca obyek dan dibiarkan selama 1 menit.
Selanjutnya kaca obyek dimiringkan untuk membuang kelebihan kristal violet lalu dibilas dengan air dari botol semprot. Sisa air di serap dengan menggunakan
kertas serap. Olesan kultur di tetesi dengan lugol dan biarkan selama 2 menit kemudian dimiringkan seperti di atas selanjutnya di bilas dengan air, sisa warna
yang masih ada dihilangkan dengan pemucat warna etanol 95, tetes demi tetes
selama 10 – 20 detik sampai zat warna kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca obyek. Cuci kembali kaca obyek dengan air mengalir lalu ditiriskan dan
selanjutnya di tetesi dengan larutan safranin selama 10 – 20 detik. Kaca obyek kemudian dimiringkan dan kembali di bilas dengan air, tiriskan dan sisa air yang
masih ada diserap dengan kertas serap. Preparat siap untuk di amati di bawah mikroskop.
Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan lensa obyektif minyak imersi 1000 x dimulai dari pembesaran terendah dan berangsur-
angsur diganti dengan pembesaran yang tinggi. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk dan cara pengelompokan tunggal, berpasangan, rantai, bergerombol dan
sebagainya. Reaksi Gram positif ditandai dengan warna sel ungu atau biru sedangkan Gram negatif berwarna merah muda. Berdasarkan keterangan
sebelumnya, diketahui bahwa bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif, ada yang berbentuk basil dan kokus.
2. Sifat Fisiologis a. Uji Katalase Nuraida 1988
