Bahan Penelitian Alat Penelitian Skema Jalannya Penelitian

35 5. Open coil spring adalah suatu alat bantu yang biasa digunakan dalam perawatan ortodontik cekat untuk membuka ruang pada kasus impaksi atau gigi yang berjejal dan distalisasi gigi molar, yang dalam penelitian ini menggunakan jenis NiTi ukuran terkecil 0,010”x 0,045” dengan panjang 1,5 kali panjang inter cleat gigi insisivus bawah marmot. Pemilihan besar gaya yang diberikan mengacu pada penelitian Lorenz dkk., yaitu dengan kompresi open coil 25 akan menghasilkan gaya 0,25 N-1,3 N, kompresi 50 akan menghasilkan gaya 0,64N-2,9N Lorenz dkk., 2011. Pada penelitian ini dengan panjang open coil 1,5 jarak inter cleat, dilakukan kompresi 13 panjang coil 33,3 maka akan dihasilkan gaya yang adekuat untuk pergerakan gigi. 6. Osteoklas merupakan sel yang berperan dalam proses resorpsi, berasal dari sel sistem hematopoetik dalam sumsum tulang, dibentuk oleh fusi progenitor mononuklear dari monocyte macrophage lineage . 7. Osteoblas merupakan sel yang berperan dalam proses aposisi, berasal dari sel stem stromal sumsum tulang atau sel-sel stem mesenkim jaringan ikat, distimulasi untuk berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi preosteoblas, kemudian akan berdiferensiasi lagi menjadi osteoblas matur. 8. Alkalin fosfatase merupakan enzim spesifik dalam tulang bone-specific isoenzyme yang diekskresi oleh osteoblas.

E. Bahan Penelitian

1. Tulang alveolaris rahang bawah marmot. 2. Risedronate sodium sebanyak 1 gr. 3. Ketamin dan xylazine untuk anastesi umum secara intramuskuler. 36 4. Opencoil spring jenis Niti ukuran 0,010” X 0,030”. 5. Bonding cleat yang dipasang pada sisi labial gigi incisivus bawah. 6. Kawat stainless stell bulat dengan diameter 0,016. 7. Bahan bonding primer dan adhesive resilience dari Ortho Technology Inc. 8. Pumish untuk brushing gigi sebelum dietsa dan dipasangi braket. 9. Paper point untuk mengambil cairan gingiva marmot. 10. Bahan untuk pemeriksaan histologis. 11. Bahan untuk uji alkalin fosfatase

F. Alat Penelitian

1. Tang klamer untuk membengkokkan kawat 2. Tang potong untuk memotong kawat dan opencoil spring 3. Pinset braket untuk memasang cleat 4. Brush untuk membersihkan gigi sebelum pemasangan braket 5. Power O untuk mengikat kawat pada cleat, Clemp untuk memasang power O 6. Kuas untuk mengoleskan bahan etsa dan primer bonding 7. Kaca mulut, Sonde explorer 8. Jangka sorong dengan ketelitian 0.01 mm 9. Spuit injeksi ukuran 1 ml untuk anestesi 10. Timbangan digital dan alat Light Curing 11. Jarum dengan ukuran 30 G 37

G. Jalannya Penelitian 1. Pembuatan sediaan hidrogel bisfosfonat risedronat

Pembuatan sediaan dilakukan di Laboratorium Riset Terpadu FKG UGM. Menggunakan zat aktif bisfosfonat risedronat yaitu sodium risedronate, dibuat sediaan dengan media pembawa gelatin hidrogel sehingga obat tersebut dapat berefek secara topikal. Gelatin 3 3 gr dilarutkan ke dalam 100 ml NaCl kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer selama 3 jam pada suhu 37°. Risedronate sodium 15,245 mg untuk pembuatan konsentrasi 500 µmolL dan 7,6272 mg untuk pembuatan konsentrasi 250 µmolL dimasukkan dan diaduk selama 2 jam. Diukur pH, dan ditambahkan NaOH sampai pH 7 netral. Campuran tersebut ditambahkan dengan larutan glutaraldehid dengan konsentrasi 25 200 µL sebagai crosslinker kemudian diaduk sampai homogen menggunakan magnetic stirrer. Setelah itu, hidrogel dicuci menggunakan glysin dan mili-Q sebanyak tiga kali masing-masing selama 15 menit untuk menghentikan reaksi crosslinking dan mengikat glutaraldehid yang tersisa. Hidrogel yang telah dicuci menggunakan glysin dimasukkan ke dalam freezer dengan suhu -30 C. Setelah proses pendinginan dilanjutkan dengan proses lyofilisasi menggunakan freeze dryer selama 48 jam. Hidrogel akan berubah bentuk dari semisolid menjadi solid blok. Matriks blok hidrogel gelatin kemudian diproses diblender menjadi sediaan microsphere . Ketika akan digunakan, sediaan ini dicampur kembali menggunakan aquades dengan perbandingan 1:20 ww sehingga terbentuk larutan semi solid. Sediaan akhir dimasukkan ke dalam spuit ukuran 30 G dan siap diaplikasikan Tabata dan Ikada, 1998. 38 Sebelum diaplikasikan, dilakukan uji release pelepasan obat dari sediaan yang sudah berbentuk microsphere. Untuk mengukur pelepasan bisfosfonat risedronat digunakan uv vis spectrophotometer dengan panjang gelombang 262 nm. Spectrophotometry adalah metode karakterisasi konsentrasi larutan dengan mengukur jumlah cahaya yang ditransmisikan melalui sampel. Dalam sampel yang jernih, seperti tabung tes berisi air, semua cahaya akan ditransmisikan. Dalam sampel lebih gelap, seperti air dengan pewarna di dalamnya, beberapa cahaya akan diserap. Jumlah cahaya yang diserap dapat dikorelasikan dengan konsentrasi pewarna Langer dan Peppas, 2003. Didalam penelitian ini dibandingkan antara ependorf yang berisi bisfosfonat risedronat murni dengan ependorf yang berisi microsphere risedronat sodium dengan media pembawa hidrogel. Sediaan microsphere hidrogel gelatin yang mengandung sodium risedronat konsentrasi 500 µmolL 400 mg mengandung 1,92 risedronat, 250 µmolL 400 mgmengandung 1 mg risedronat, bisfosfonat risedronat murni 1,92 mg dan bisfosfonat risedronat murni 1 mg tanpa media pembawa, dimasukkan kedalam ependorf dan dilarutkan dalam PBS. Masing masing sampel dibuat replikasi 3 ependorf, dilakukan inkubasi 37°C selama 1 jam. Kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit, diambil 500 µl supernatan dan di ukur absorbansinya dengan uv vis spectrophotometer. Ependorf yang sudah terambil 500 µl, ditambahkan dengan larutan PBS baru sebesar 500 µl dan kembali diinkubasi 37° selama 3 jam. Kemudian dilakukan perlakuan yang sama untuk pengukuran pada interval waktu 3 jam, 6 jam dan 24 jam Saito dan Tabata, 2012 39

2. Perlakuan pada hewan coba

Penelitian dengan hewan coba marmot telah mendapat persetujuan dari Komisi Etik Penelitian FKG UGM dengan nomor 355KKEPFKG- UGMEC2012. Aklimatisasi marmot selama 1 minggu sebelum diberi perlakuan untuk adaptasi dengan tempat dan makanan laboratorium. Perlakuan pada hewan uji dilakukan di LPPT Unit IV UGM. Dilakukan penimbangan berat badan marmot yang sesuai dengan kriteria 350-550 mg. Marmot dianastesi dengan ketamin 0.1 ml dan xylasin 0.1 ml dengan injeksi intramuscular di paha dosis 6-12 mgkgBB, kemudian dilakukan pemasangan separator diantara kedua gigi insisivus untuk memudahkan pemasangan lingual bonding cleat . Dilanjutkan dengan pemberian etsa pada permukaan labial gigi insisivus tersebut dan pemasangan lingual bonding cleat . Kawat stainless stell bulat dengan diameter 0,016 dan open coil spring dengan panjang 1,5 kali jarak inter cleat dipasangkan diantara lingual bonding cleat . Dengan kompresi 13 panjang open coil spring akan diperoleh gaya yang adekuat untuk pergerakan gigi Gambar 3.2. 40 Gambar 3.2. Proses Menggerakkan gigi A. Gigi insisivus bawah marmot, B. Pemasangan Separator Pemberian Etsa, C. pemasangan bonding cleat , D. Pemasangan open coil spring, E. Menggerakkan gigi Setelah gigi bergerak dan opencoil spring sudah tidak aktif, dilakukan penggantian opencoil spring sesuai jarak intercleat yang baru sampai diperoleh jarak interinsisivus sebesar ± 3 mm membutuhkan waktu sekitar 14 hari. Jarak ± 3 mm dipertahankan selama 14 hari sebagai periode stabilisasi. Pada kelompok perlakuan selama periode stabilisasi sudah dilakukan aplikasi intrasulkuler bisfosfonat risedronat hidrogel setiap 3 hari Gambar 3.4. Setelah periode stabilisasi selama 14 hari, kawat dan open coil dilepas, pada kelompok perlakuan tetap diberikan bisfosfonat risedronat hidrogel dan dilakukan pengamatan relaps gigi pada hari ke-0, 3, 7, 14 dan 21 Gambar 3.3. 41 Gambar 3.3. A. Pengukuran jarak dengan jangka sorong, B. Pengambilan cairan krevikuler gingiva dengan paper point . Gambar 3.4 Aplikasi intrasulkuler hidrogel bisfosfonat risedronat di area sulkus gingiva bagian mesial dengan jarum ukuran 30 G Subjek pada penelitian ini adalah 75 ekor marmot yang dibagi menjadi 3 kelompok yaitu 25 marmot tanpa bisfosfonat, 25 marmot mendapat bisfosfonat risedronat intrasulkuler dosis 250 µmolL dan 25 marmot dosis 500 µmolL.

3. Pengukuran Variabel a. Pengukuran relaps

gigi menggunakan jangka sorong Pengukuran relaps gigi dengan cara mengukur jarak interinsisivus pada hari ke-0, 3, 7, 14, 21 menggunakan jangka sorong dengan tingkat ketelitian 0.05 mm. 42

b. Pengukuran Alkalin fosfatase ALP

Pengambilan Sampel: dilakukan pada hari ke-0, 3, 7, 14, 21 setelah bonding cleat dilepas. Pengambilan cairan krevikuler gingiva dilakukan dengan cara gigi insisivus bawah marmot dibersihkan dengan bulatan kapas untuk menghilangkan plak supragingival, diisolasi dengan gulungan kapas dan dikeringkan. Paper point , dimasukkan kurang lebih 1 mm kedalam sulkus gingiva selama 30 detik dengan interval 90 detik untuk meningkatkan volume cairan GCF yang diambil tiap sisi. Kemudian dimasukkan ke dalam tube eppendorf ukuran 1.5 ml yang berisi 350 µl larutan salin fisiologis. Tube eppendorf disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 2000 rpm untuk mengelusi komponen GCF secara lengkap. Paper point diambil dan larutan supernatant disimpan pada suhu -80°C sampai dianalisis maksimum selama 1 minggu. Aktivitas ALP ditentukan menggunakan spektrofotometer model 6330 Jenway UK pada panjang gelombang 405 nm. Sekitar 50 µL dari 40 mM carbonate buffer pH 9,8 dengan 3 mM MgCl2 diambil dengan pipet dimasukkan ependorf. Kemudian 50 µL sampel GCF dan 50 µL dari 3mM p-nitrophenylphosphate ditambahkan pada tube yang sama. Sampel tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit 37°C. Reaksi enzimatis dihentikan dengan menambahkan 50 µL dari 0.6 M sodium hydroxide dan absorbansi diukur dengan segera pada panjang gelombang 405 nm. Jumlah dari p-nitrophenol yang terbentuk diukur menggunakan kurva standar yang disiapkan dari phosphatase subtrate sigma 104, Sigma-Aldrich, St Louis, USA. Aktivitas ALP disajikan dalam bentuk enzyme unit U. Unit didefinisikan sebagai jumlah pelepasan p-nitrophenol µmol per menit pada suhu 37°C Asma dkk., 2008. Pemeriksaan aktivitas ALP 43 dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran UGM dengan menggunakan uji spektrofotometri.

c. Pengukuran jumlah osteoklas dengan pewarnaan TRAP

Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Menggunakan mikroskop optilab dilakukan pemotretan slide dalam 5 lapang pandang. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah osteoklas menggunakan program image raster . Preparasi spesimen Dilakukan di Laboratorium LPPT Unit IV UGM. Marmot dianastesi dengan ketamin 0.1 ml dan xylasin 0.1 ml dengan injeksi intramuscular di paha dosis 6-12 mgkgBB, kemudian diperfusi intrakardial dengan menggunakan larutan NaCl kemudian dilanjutkkan dengan 4 paraformaldehida. Dilakukan diseksi tulang alveolar rahang bawah sampai seluruh sisi mesial maupun distal gigi insisivus bawah kanan dan kiri serta ujung akar gigi dapat terambil. Kemudian potongan jaringan difiksasi menggunakan 4 paraformaldehida suhu 4°C selama 12 jam. Sampel kemudian didemineralisasi menggunakan 10 EDTA suhu 4°C sampai lunak bisa dipotong dalam penelitian ini ± 60 hari dimana larutan EDTA diganti setiap 5 hari. Spesimen didehidrasi menggunakan alkohol bertingkat pada suhu 4°C, xylol akohol, xylol murni dan xylol parafin suhu kamar. Dilakukan pembuatan blok parafin, dipotong sagital berseri ketebalan ± 6 µm paralel sumbu panjang gigi. Setelah dilakukan deparafinisasi dilakukan pewarnaan TRAP Anan dkk., 1993. 44 Pengecatan dengan Pewarnaan TRAP Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Pengecatan TRAP ini dilakukan untuk meneliti keadaan sel-sel tulang, dan dapat berfungsi sebagai penanda khusus untuk sel osteoklas dan preosteoklas. Pengecatan menggunakan larutan napthol ASBI phosphate sebagai substrat. Larutan substrat dan coupler Tris HCL, Sodium Nitrit yang sudah ditetesi pararosalini kemudian dicampur dan disebut reagen asam fosfatase acid phosphatase reagent . Inhibisi non osteoclastic acid phosphatase penghambat asam fosfatase yang bukan osteoklas menggunakan 50 mML + asam tartrat. Irisan specimen ditetesi dengan menggunakan 2-3 tetes pewarna. Spesimen kemudian diinkubasi 20-30 menit pada suhu 37°C, selanjutnya segera dicuci dengan menggunakan air distilasi selama 2 menit. Spesimen diletakkan dalam alkohol 70 pada suhu kamar selama 30 menit. Spesimen dicuci lagi menggunakan air distilasi selama 2 menit sebanyak 2 kali. Dilakukan counter pewarnaan menggunakan methyl green Wijngaert dkk., 1988. Pengamatan Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Preparat yang telah diwarnai diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya untuk dilihat jumlah sel osteoklas. Dengan menggunakan pewarnaan TRAP, sel osteoklas aktif terlihat berkontak dengan tulang. Sel Osteoklas akan menunjukkan TRAP + dengan ciri ciri besar, biasanya berinti banyak, dengan bentuk inti tak teratur serta berwarna merah terang pada granula sitoplasmanya. Osteoklas ditemukan kontak dengan permukaan tulang dan didalam lacuna Baroukh dan Saffar, 1991. Data 45 didapat dengan menghitung rata rata jumlah sel dari 5 lapang pandang yang diambil secara acak pada irisan preparat. Gambar 3.5. Dengan pewarnaan TRAP : A. Pengambilan 5 lapang pandang dalam satu slide salah di satu sisi mesial. B. Gambaran osteoklas dalam satu lapang pandang

d. Pengukuran rasio osteoklas dan osteoblas

Proses pembuatan preparat dan pewarnaan dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM menggunakan pewarnaan HE Hematoksilin Eosin. Penghitungan jumlah osteoklas dan osteoblas dilakukan di Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan UGM. Data didapat dengan menghitung rerata jumlah sel osteoklas dan osteoblas dari 3 lapang pandang yang diambil secara acak pada irisan preparat. Osteoklas berupa sel multinuklear yang mengandung 4-20 nukleus. Osteoklas ditemukan kontak dengan permukaan tulang dan didalam lacuna. Osteoblas ditemukan dalam kelompok-kelompok sel kuboid di sepanjang sel tepi tulang baru. Gambar 3.6. Dengan pewarnaan HE : A. Pengambilan 3 lapang pandang dalam satu slide salah satu sisi mesial. B. Gambaran osteoklas osteoblas dalam satu lapang pandang. 46

H. Skema Jalannya Penelitian

75 Marmot, Aklimatisasi selama 7 hari ↓ PemakaianPemasangan Braket lingual bonding cleat dan open coil spring ↓ Adaptasi 1 hari ↓ Pengaktifan Open coil spring ± 14 hari ↓ Stabilisasi Open coil ± 14 hari │ ↓ ↓ ↓ Tanpa Bisfosfonat A N=25 Aplikasi intrasulkuler bisfosfonat risedronat 250µmolL B setiap 3 hari sekali sampai hari dekapitasi N=25 Aplikasi bisfosfonat risedronat intrasulkuler dosis 500µmolL C setiap 3 hari sekali sampai hari dekapitasi N=25 ↓ ↓ ↓ Open coil dilepas Open coil dilepas Open coil dilepas ↓ ↓ ↓ Diukur jarak interinsisivus, osteoklas, rasio osteoklas osteoblas, kadar ALP pada hari ke- Diukur jarak interinsisivus, osteoklas, rasio osteoklas osteoblas, kadar ALP pada hari ke- Diukur jarak interinsisivus, osteoklas, rasio osteoklas osteoblas, kadar ALP pada hari ke- ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ A1 N=5 3 A2 N=5 7 A3 N=5 14 A4 N=5 21 A5 N=5 B1 N=5 3 B2 N=5 7 B3 N=5 14 B4 N=5 21 B5 N=5 C1 N=5 3 C2 N=5 7 C3 N=5 14 C4 N=5 21 C5 N=5 Gambar 3.7. Skema Jalannya Penelitian 47

I. Analisis Data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini dicatat, dikumpulkan, dan dianalisis secara statistik dengan SPSS menggunakan: 1. Uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui apakah data yang diperoleh terdistribusi normal. 2. Test of Homegeneity of Variances untuk mengetahui apakah data yang diperoleh homogen. 3. Uji Anava satu jalur untuk mengetahui apakah ada perbedaan antar kelompok jika data terdistribusi normal dan homogen. Uji non parametrik Kruskal Wallis jika data tidak terdistribusi normal atau tidak homogen. 4. Uji Multiple Comparison LSD untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan. 5. Uji Anava dua jalur untuk mengetahui interaksi antar dua faktor waktu dan konsentrasi.