35
5.
Open coil spring
adalah suatu alat bantu yang biasa digunakan dalam perawatan ortodontik cekat untuk membuka ruang pada kasus impaksi atau gigi yang
berjejal dan distalisasi gigi molar, yang dalam penelitian ini menggunakan jenis NiTi ukuran terkecil
0,010”x 0,045” dengan panjang 1,5 kali panjang inter
cleat
gigi insisivus bawah marmot. Pemilihan besar gaya yang diberikan mengacu pada penelitian Lorenz dkk., yaitu dengan kompresi open coil 25 akan
menghasilkan gaya 0,25 N-1,3 N, kompresi 50 akan menghasilkan gaya 0,64N-2,9N Lorenz dkk., 2011. Pada penelitian ini dengan panjang open coil
1,5 jarak inter cleat, dilakukan kompresi 13 panjang coil 33,3 maka akan dihasilkan gaya yang adekuat untuk pergerakan gigi.
6. Osteoklas merupakan sel yang berperan dalam proses resorpsi, berasal dari sel
sistem hematopoetik dalam sumsum tulang, dibentuk oleh fusi progenitor mononuklear dari
monocyte macrophage lineage
. 7.
Osteoblas merupakan sel yang berperan dalam proses aposisi, berasal dari sel stem stromal sumsum tulang atau sel-sel stem mesenkim jaringan ikat,
distimulasi untuk berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi preosteoblas, kemudian akan berdiferensiasi lagi menjadi osteoblas matur.
8. Alkalin fosfatase merupakan enzim spesifik dalam tulang
bone-specific isoenzyme
yang diekskresi oleh osteoblas.
E. Bahan Penelitian
1. Tulang alveolaris rahang bawah marmot.
2. Risedronate sodium sebanyak 1 gr.
3. Ketamin dan xylazine untuk anastesi umum secara intramuskuler.
36
4.
Opencoil spring
jenis Niti ukuran 0,010” X 0,030”. 5.
Bonding cleat
yang dipasang pada sisi labial gigi incisivus bawah. 6.
Kawat
stainless stell
bulat dengan diameter 0,016. 7.
Bahan bonding primer dan
adhesive resilience
dari Ortho Technology Inc. 8.
Pumish
untuk
brushing
gigi sebelum dietsa dan dipasangi braket. 9.
Paper point
untuk mengambil cairan gingiva marmot. 10.
Bahan untuk pemeriksaan histologis. 11.
Bahan untuk uji alkalin fosfatase
F. Alat Penelitian
1. Tang klamer untuk membengkokkan kawat
2.
Tang potong untuk memotong kawat dan
opencoil spring
3. Pinset braket untuk memasang
cleat
4.
Brush
untuk membersihkan gigi sebelum pemasangan braket 5.
Power O untuk mengikat kawat pada
cleat, Clemp
untuk memasang power O 6.
Kuas untuk mengoleskan bahan etsa dan primer bonding 7.
Kaca mulut, Sonde explorer 8.
Jangka sorong dengan ketelitian 0.01 mm 9.
Spuit injeksi ukuran 1 ml untuk anestesi 10.
Timbangan digital dan alat
Light Curing
11. Jarum dengan ukuran 30 G
37
G. Jalannya Penelitian 1. Pembuatan sediaan hidrogel bisfosfonat risedronat
Pembuatan sediaan dilakukan di Laboratorium Riset Terpadu FKG UGM. Menggunakan zat aktif bisfosfonat risedronat yaitu sodium risedronate, dibuat
sediaan dengan media pembawa gelatin hidrogel sehingga obat tersebut dapat berefek secara topikal. Gelatin 3 3 gr dilarutkan ke dalam 100 ml NaCl
kemudian dihomogenisasi dengan
magnetic stirrer
selama 3 jam pada suhu 37°. Risedronate sodium 15,245 mg untuk pembuatan konsentrasi 500 µmolL dan
7,6272 mg untuk pembuatan konsentrasi 250 µmolL dimasukkan dan diaduk selama 2 jam. Diukur pH, dan ditambahkan NaOH sampai pH 7 netral. Campuran
tersebut ditambahkan dengan larutan glutaraldehid dengan konsentrasi 25 200 µL sebagai
crosslinker
kemudian diaduk sampai homogen menggunakan
magnetic stirrer.
Setelah itu, hidrogel dicuci menggunakan glysin dan mili-Q sebanyak tiga kali masing-masing selama 15 menit untuk menghentikan reaksi crosslinking dan
mengikat glutaraldehid yang tersisa. Hidrogel yang telah dicuci menggunakan glysin dimasukkan ke dalam
freezer
dengan suhu -30 C. Setelah proses pendinginan dilanjutkan dengan proses
lyofilisasi
menggunakan
freeze dryer
selama 48 jam. Hidrogel akan berubah bentuk dari semisolid menjadi solid blok. Matriks blok hidrogel gelatin kemudian
diproses diblender menjadi sediaan
microsphere
. Ketika akan digunakan, sediaan ini dicampur kembali menggunakan aquades dengan perbandingan 1:20 ww
sehingga terbentuk larutan semi solid. Sediaan akhir dimasukkan ke dalam spuit ukuran 30 G dan siap diaplikasikan Tabata dan Ikada, 1998.
38
Sebelum diaplikasikan, dilakukan uji
release
pelepasan obat dari sediaan yang sudah berbentuk
microsphere.
Untuk mengukur pelepasan bisfosfonat risedronat digunakan
uv vis spectrophotometer
dengan panjang gelombang 262
nm.
Spectrophotometry
adalah metode karakterisasi konsentrasi larutan dengan mengukur jumlah cahaya yang ditransmisikan melalui sampel. Dalam sampel yang
jernih, seperti tabung tes berisi air, semua cahaya akan ditransmisikan. Dalam sampel lebih gelap, seperti air dengan pewarna di dalamnya, beberapa cahaya akan
diserap. Jumlah cahaya yang diserap dapat dikorelasikan dengan konsentrasi pewarna Langer dan Peppas, 2003. Didalam penelitian ini dibandingkan antara
ependorf yang berisi bisfosfonat risedronat murni dengan ependorf yang berisi
microsphere
risedronat sodium dengan media pembawa hidrogel. Sediaan
microsphere
hidrogel gelatin yang mengandung sodium risedronat konsentrasi 500 µmolL 400 mg mengandung 1,92 risedronat, 250 µmolL 400
mgmengandung 1 mg risedronat, bisfosfonat risedronat murni 1,92 mg dan bisfosfonat risedronat murni 1 mg tanpa media pembawa, dimasukkan kedalam
ependorf dan dilarutkan dalam PBS. Masing masing sampel dibuat replikasi 3 ependorf, dilakukan inkubasi 37°C selama 1 jam. Kemudian di sentrifuse dengan
kecepatan 3000 rpm selama 20 menit, diambil 500 µl supernatan dan di ukur absorbansinya dengan
uv vis spectrophotometer.
Ependorf yang sudah terambil 500 µl, ditambahkan dengan larutan PBS baru sebesar 500 µl dan kembali diinkubasi
37° selama 3 jam. Kemudian dilakukan perlakuan yang sama untuk pengukuran pada interval waktu 3 jam, 6 jam dan 24 jam Saito dan Tabata, 2012
39
2. Perlakuan pada hewan coba
Penelitian dengan hewan coba marmot telah mendapat persetujuan dari Komisi
Etik Penelitian
FKG UGM
dengan nomor
355KKEPFKG- UGMEC2012. Aklimatisasi marmot selama 1 minggu sebelum diberi perlakuan
untuk adaptasi dengan tempat dan makanan laboratorium. Perlakuan pada hewan uji dilakukan di LPPT Unit IV UGM. Dilakukan
penimbangan berat badan marmot yang sesuai dengan kriteria 350-550 mg. Marmot dianastesi dengan ketamin 0.1 ml dan xylasin 0.1 ml dengan injeksi
intramuscular di paha dosis 6-12 mgkgBB, kemudian dilakukan pemasangan separator diantara kedua gigi insisivus untuk memudahkan pemasangan
lingual bonding cleat
. Dilanjutkan dengan pemberian etsa pada permukaan labial gigi insisivus tersebut dan pemasangan
lingual bonding cleat
. Kawat
stainless stell
bulat dengan diameter 0,016 dan
open coil spring
dengan panjang 1,5 kali jarak
inter cleat
dipasangkan diantara
lingual bonding cleat
. Dengan kompresi 13 panjang
open coil spring
akan diperoleh gaya yang adekuat untuk pergerakan gigi Gambar 3.2.
40
Gambar 3.2. Proses Menggerakkan gigi A. Gigi insisivus bawah marmot, B.
Pemasangan Separator Pemberian Etsa, C. pemasangan
bonding cleat
, D. Pemasangan
open coil spring,
E. Menggerakkan gigi
Setelah gigi bergerak dan
opencoil spring
sudah tidak aktif, dilakukan penggantian
opencoil spring
sesuai jarak
intercleat
yang baru sampai diperoleh jarak interinsisivus sebesar ± 3 mm membutuhkan waktu sekitar 14 hari. Jarak ±
3 mm dipertahankan selama 14 hari sebagai periode stabilisasi. Pada kelompok perlakuan selama periode stabilisasi sudah dilakukan aplikasi intrasulkuler
bisfosfonat risedronat hidrogel setiap 3 hari Gambar 3.4. Setelah periode stabilisasi selama 14 hari, kawat dan
open coil
dilepas, pada kelompok perlakuan tetap diberikan bisfosfonat risedronat hidrogel dan dilakukan pengamatan relaps
gigi pada hari ke-0, 3, 7, 14 dan 21 Gambar 3.3.
41
Gambar 3.3. A. Pengukuran jarak dengan jangka sorong, B. Pengambilan cairan
krevikuler gingiva dengan
paper point
.
Gambar 3.4 Aplikasi intrasulkuler hidrogel bisfosfonat risedronat di area
sulkus gingiva bagian mesial dengan jarum ukuran 30 G
Subjek pada penelitian ini adalah 75 ekor marmot yang dibagi menjadi 3 kelompok yaitu 25 marmot tanpa bisfosfonat, 25 marmot mendapat bisfosfonat
risedronat intrasulkuler dosis 250 µmolL dan 25 marmot dosis 500 µmolL.
3. Pengukuran Variabel a. Pengukuran relaps
gigi menggunakan jangka sorong
Pengukuran relaps gigi dengan cara mengukur jarak interinsisivus pada hari ke-0, 3, 7, 14, 21 menggunakan jangka sorong dengan tingkat ketelitian 0.05 mm.
42
b. Pengukuran Alkalin fosfatase ALP
Pengambilan Sampel: dilakukan pada hari ke-0, 3, 7, 14, 21 setelah
bonding cleat
dilepas. Pengambilan cairan krevikuler gingiva dilakukan dengan cara gigi insisivus bawah marmot dibersihkan dengan bulatan kapas untuk menghilangkan
plak supragingival, diisolasi dengan gulungan kapas dan dikeringkan.
Paper point
, dimasukkan kurang lebih 1 mm kedalam sulkus gingiva selama 30 detik dengan
interval 90 detik untuk meningkatkan volume cairan GCF yang diambil tiap sisi. Kemudian dimasukkan ke dalam tube eppendorf ukuran 1.5 ml yang berisi 350 µl
larutan salin fisiologis. Tube eppendorf disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 2000 rpm untuk mengelusi komponen GCF secara lengkap.
Paper point
diambil dan larutan supernatant disimpan pada suhu -80°C sampai dianalisis maksimum selama 1 minggu. Aktivitas ALP ditentukan menggunakan
spektrofotometer model 6330 Jenway UK pada panjang gelombang 405 nm. Sekitar 50 µL dari 40 mM carbonate buffer pH 9,8 dengan 3 mM MgCl2 diambil
dengan pipet dimasukkan ependorf. Kemudian 50 µL sampel GCF dan 50 µL dari 3mM p-nitrophenylphosphate ditambahkan pada
tube
yang sama. Sampel tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit 37°C. Reaksi enzimatis dihentikan dengan
menambahkan 50 µL dari 0.6 M sodium hydroxide dan absorbansi diukur dengan segera pada panjang gelombang 405 nm. Jumlah dari
p-nitrophenol
yang terbentuk diukur menggunakan kurva standar yang disiapkan dari
phosphatase subtrate
sigma 104, Sigma-Aldrich, St Louis, USA. Aktivitas ALP disajikan dalam bentuk enzyme unit U. Unit didefinisikan sebagai jumlah pelepasan
p-nitrophenol
µmol per menit pada suhu 37°C Asma dkk., 2008. Pemeriksaan aktivitas ALP
43
dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran UGM dengan menggunakan uji spektrofotometri.
c. Pengukuran jumlah osteoklas dengan pewarnaan TRAP
Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Menggunakan mikroskop optilab dilakukan pemotretan slide dalam 5 lapang
pandang. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah osteoklas menggunakan program
image raster
.
Preparasi spesimen
Dilakukan di Laboratorium LPPT Unit IV UGM. Marmot dianastesi dengan ketamin 0.1 ml dan xylasin 0.1 ml dengan injeksi intramuscular di paha dosis
6-12 mgkgBB, kemudian diperfusi intrakardial dengan menggunakan larutan NaCl kemudian dilanjutkkan dengan 4 paraformaldehida. Dilakukan diseksi
tulang alveolar rahang bawah sampai seluruh sisi mesial maupun distal gigi insisivus bawah kanan dan kiri serta ujung akar gigi dapat terambil. Kemudian
potongan jaringan difiksasi menggunakan 4 paraformaldehida suhu 4°C selama 12 jam. Sampel kemudian didemineralisasi menggunakan 10 EDTA suhu 4°C
sampai lunak bisa dipotong dalam penelitian ini ± 60 hari dimana larutan EDTA diganti setiap 5 hari. Spesimen didehidrasi menggunakan alkohol bertingkat pada
suhu 4°C, xylol akohol, xylol murni dan xylol parafin suhu kamar. Dilakukan pembuatan blok parafin, dipotong sagital berseri ketebalan ± 6 µm paralel sumbu
panjang gigi. Setelah dilakukan deparafinisasi dilakukan pewarnaan TRAP Anan dkk., 1993.
44
Pengecatan dengan Pewarnaan TRAP
Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Pengecatan TRAP ini dilakukan untuk meneliti keadaan sel-sel tulang, dan dapat berfungsi
sebagai penanda khusus untuk sel osteoklas dan preosteoklas. Pengecatan menggunakan larutan
napthol ASBI phosphate
sebagai substrat. Larutan substrat dan
coupler
Tris HCL, Sodium Nitrit yang sudah ditetesi pararosalini kemudian dicampur dan disebut reagen asam fosfatase
acid phosphatase reagent
.
Inhibisi non osteoclastic acid phosphatase
penghambat asam fosfatase yang bukan osteoklas menggunakan 50 mML + asam tartrat. Irisan specimen ditetesi dengan
menggunakan 2-3 tetes pewarna. Spesimen kemudian diinkubasi 20-30 menit pada suhu 37°C, selanjutnya segera dicuci dengan menggunakan air distilasi selama 2
menit. Spesimen diletakkan dalam alkohol 70 pada suhu kamar selama 30 menit. Spesimen dicuci lagi menggunakan air distilasi selama 2 menit sebanyak 2 kali.
Dilakukan counter pewarnaan menggunakan
methyl green
Wijngaert dkk., 1988.
Pengamatan
Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Preparat yang telah diwarnai diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya untuk dilihat
jumlah sel osteoklas. Dengan menggunakan pewarnaan TRAP, sel osteoklas aktif terlihat berkontak dengan tulang. Sel Osteoklas akan menunjukkan TRAP + dengan
ciri ciri besar, biasanya berinti banyak, dengan bentuk inti tak teratur serta berwarna merah terang pada granula sitoplasmanya. Osteoklas ditemukan kontak
dengan permukaan tulang dan didalam
lacuna
Baroukh dan Saffar, 1991. Data
45
didapat dengan menghitung rata rata jumlah sel dari 5 lapang pandang yang
diambil secara acak pada irisan preparat.
Gambar 3.5. Dengan pewarnaan TRAP : A. Pengambilan 5 lapang
pandang dalam satu slide salah di satu sisi mesial. B. Gambaran osteoklas
dalam satu lapang pandang
d. Pengukuran rasio osteoklas dan osteoblas
Proses pembuatan preparat dan pewarnaan dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM menggunakan pewarnaan HE Hematoksilin
Eosin. Penghitungan jumlah osteoklas dan osteoblas dilakukan di Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan UGM. Data didapat dengan menghitung
rerata jumlah sel osteoklas dan osteoblas dari 3 lapang pandang yang diambil secara acak pada irisan preparat. Osteoklas berupa sel multinuklear yang
mengandung 4-20 nukleus. Osteoklas ditemukan kontak dengan permukaan tulang dan didalam
lacuna.
Osteoblas ditemukan dalam kelompok-kelompok sel kuboid di sepanjang sel tepi tulang baru.
Gambar 3.6. Dengan pewarnaan HE : A. Pengambilan 3 lapang pandang dalam satu
slide salah satu sisi mesial. B. Gambaran osteoklas osteoblas dalam satu lapang
pandang.
46
H. Skema Jalannya Penelitian
75 Marmot, Aklimatisasi selama 7 hari
↓
PemakaianPemasangan Braket
lingual bonding cleat
dan
open coil spring
↓
Adaptasi 1 hari
↓
Pengaktifan Open coil spring ± 14 hari
↓
Stabilisasi Open coil ± 14 hari
│
↓ ↓
↓
Tanpa Bisfosfonat A N=25
Aplikasi intrasulkuler bisfosfonat risedronat 250µmolL B setiap 3 hari sekali sampai
hari dekapitasi N=25 Aplikasi bisfosfonat risedronat intrasulkuler
dosis 500µmolL C setiap 3 hari sekali sampai hari dekapitasi N=25
↓ ↓
↓
Open coil dilepas Open coil dilepas
Open coil dilepas
↓ ↓
↓
Diukur jarak interinsisivus, osteoklas, rasio osteoklas osteoblas, kadar ALP pada hari
ke- Diukur jarak interinsisivus, osteoklas, rasio
osteoklas osteoblas, kadar ALP pada hari ke-
Diukur jarak interinsisivus, osteoklas, rasio osteoklas osteoblas, kadar ALP pada hari
ke-
↓ ↓
↓
↓ ↓
↓ ↓
↓ ↓
↓ ↓
↓ ↓
↓ ↓
↓ ↓
↓
A1 N=5
3 A2
N=5 7
A3 N=5
14 A4
N=5 21
A5 N=5
B1 N=5
3 B2
N=5 7
B3 N=5
14 B4
N=5 21
B5 N=5
C1 N=5
3 C2
N=5 7
C3 N=5
14 C4
N=5 21
C5 N=5
Gambar 3.7. Skema Jalannya Penelitian
47
I. Analisis Data
Data yang diperoleh dalam penelitian ini dicatat, dikumpulkan, dan dianalisis secara statistik dengan SPSS menggunakan:
1. Uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui apakah data yang diperoleh terdistribusi
normal. 2.
Test of Homegeneity of Variances
untuk mengetahui apakah data yang diperoleh homogen.
3. Uji Anava satu jalur untuk mengetahui apakah ada perbedaan antar
kelompok jika data terdistribusi normal dan homogen. Uji non parametrik Kruskal Wallis jika data tidak terdistribusi normal atau tidak homogen.
4. Uji Multiple Comparison LSD untuk mengetahui kelompok mana yang
memiliki perbedaan.
5.
Uji Anava dua jalur untuk mengetahui interaksi antar dua faktor waktu dan konsentrasi.