42
b. Pengukuran Alkalin fosfatase ALP
Pengambilan Sampel: dilakukan pada hari ke-0, 3, 7, 14, 21 setelah
bonding cleat
dilepas. Pengambilan cairan krevikuler gingiva dilakukan dengan cara gigi insisivus bawah marmot dibersihkan dengan bulatan kapas untuk menghilangkan
plak supragingival, diisolasi dengan gulungan kapas dan dikeringkan.
Paper point
, dimasukkan kurang lebih 1 mm kedalam sulkus gingiva selama 30 detik dengan
interval 90 detik untuk meningkatkan volume cairan GCF yang diambil tiap sisi. Kemudian dimasukkan ke dalam tube eppendorf ukuran 1.5 ml yang berisi 350 µl
larutan salin fisiologis. Tube eppendorf disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 2000 rpm untuk mengelusi komponen GCF secara lengkap.
Paper point
diambil dan larutan supernatant disimpan pada suhu -80°C sampai dianalisis maksimum selama 1 minggu. Aktivitas ALP ditentukan menggunakan
spektrofotometer model 6330 Jenway UK pada panjang gelombang 405 nm. Sekitar 50 µL dari 40 mM carbonate buffer pH 9,8 dengan 3 mM MgCl2 diambil
dengan pipet dimasukkan ependorf. Kemudian 50 µL sampel GCF dan 50 µL dari 3mM p-nitrophenylphosphate ditambahkan pada
tube
yang sama. Sampel tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit 37°C. Reaksi enzimatis dihentikan dengan
menambahkan 50 µL dari 0.6 M sodium hydroxide dan absorbansi diukur dengan segera pada panjang gelombang 405 nm. Jumlah dari
p-nitrophenol
yang terbentuk diukur menggunakan kurva standar yang disiapkan dari
phosphatase subtrate
sigma 104, Sigma-Aldrich, St Louis, USA. Aktivitas ALP disajikan dalam bentuk enzyme unit U. Unit didefinisikan sebagai jumlah pelepasan
p-nitrophenol
µmol per menit pada suhu 37°C Asma dkk., 2008. Pemeriksaan aktivitas ALP
43
dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran UGM dengan menggunakan uji spektrofotometri.
c. Pengukuran jumlah osteoklas dengan pewarnaan TRAP
Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Menggunakan mikroskop optilab dilakukan pemotretan slide dalam 5 lapang
pandang. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah osteoklas menggunakan program
image raster
.
Preparasi spesimen
Dilakukan di Laboratorium LPPT Unit IV UGM. Marmot dianastesi dengan ketamin 0.1 ml dan xylasin 0.1 ml dengan injeksi intramuscular di paha dosis
6-12 mgkgBB, kemudian diperfusi intrakardial dengan menggunakan larutan NaCl kemudian dilanjutkkan dengan 4 paraformaldehida. Dilakukan diseksi
tulang alveolar rahang bawah sampai seluruh sisi mesial maupun distal gigi insisivus bawah kanan dan kiri serta ujung akar gigi dapat terambil. Kemudian
potongan jaringan difiksasi menggunakan 4 paraformaldehida suhu 4°C selama 12 jam. Sampel kemudian didemineralisasi menggunakan 10 EDTA suhu 4°C
sampai lunak bisa dipotong dalam penelitian ini ± 60 hari dimana larutan EDTA diganti setiap 5 hari. Spesimen didehidrasi menggunakan alkohol bertingkat pada
suhu 4°C, xylol akohol, xylol murni dan xylol parafin suhu kamar. Dilakukan pembuatan blok parafin, dipotong sagital berseri ketebalan ± 6 µm paralel sumbu
panjang gigi. Setelah dilakukan deparafinisasi dilakukan pewarnaan TRAP Anan dkk., 1993.
44
Pengecatan dengan Pewarnaan TRAP
Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Pengecatan TRAP ini dilakukan untuk meneliti keadaan sel-sel tulang, dan dapat berfungsi
sebagai penanda khusus untuk sel osteoklas dan preosteoklas. Pengecatan menggunakan larutan
napthol ASBI phosphate
sebagai substrat. Larutan substrat dan
coupler
Tris HCL, Sodium Nitrit yang sudah ditetesi pararosalini kemudian dicampur dan disebut reagen asam fosfatase
acid phosphatase reagent
.
Inhibisi non osteoclastic acid phosphatase
penghambat asam fosfatase yang bukan osteoklas menggunakan 50 mML + asam tartrat. Irisan specimen ditetesi dengan
menggunakan 2-3 tetes pewarna. Spesimen kemudian diinkubasi 20-30 menit pada suhu 37°C, selanjutnya segera dicuci dengan menggunakan air distilasi selama 2
menit. Spesimen diletakkan dalam alkohol 70 pada suhu kamar selama 30 menit. Spesimen dicuci lagi menggunakan air distilasi selama 2 menit sebanyak 2 kali.
Dilakukan counter pewarnaan menggunakan
methyl green
Wijngaert dkk., 1988.
Pengamatan
Dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UGM. Preparat yang telah diwarnai diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya untuk dilihat
jumlah sel osteoklas. Dengan menggunakan pewarnaan TRAP, sel osteoklas aktif terlihat berkontak dengan tulang. Sel Osteoklas akan menunjukkan TRAP + dengan
ciri ciri besar, biasanya berinti banyak, dengan bentuk inti tak teratur serta berwarna merah terang pada granula sitoplasmanya. Osteoklas ditemukan kontak
dengan permukaan tulang dan didalam
lacuna
Baroukh dan Saffar, 1991. Data
45
didapat dengan menghitung rata rata jumlah sel dari 5 lapang pandang yang
diambil secara acak pada irisan preparat.
Gambar 3.5. Dengan pewarnaan TRAP : A. Pengambilan 5 lapang
pandang dalam satu slide salah di satu sisi mesial. B. Gambaran osteoklas
dalam satu lapang pandang
d. Pengukuran rasio osteoklas dan osteoblas
Kategori