31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sehingga larutan commassie blue yang memberikan warna biru masih terlihat sangat pekat pada gel SDS PAGE.
4.8 Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan
Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV
Uji aktivitas inhibisi fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam terhadap enzim RNA helikase HCV menggunakan metode
kolorimetri ATPase. Uji kolorimetri ATPase memerlukan larutan master mix. Larutan ini terdiri dari air suling, asam 4-morfolinopropana sulfonat
MOPS, MgCl
2
, adenosin trifosfat ATP dan enzim RNA helikase yang telah diencerkan dengan aquades. MOPS berperan sebagai dapar dalam
larutan master mix. Buffer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas enzim. ATP yang ditambahkan berperan sebagai substrat pada pengujian ATPase
kolorimetri. Mg
2+
diperlukan sebagai kofaktor RNA helikase sehingga MgCl
2
berfungsi sebagai donor kofaktor dalam master mix. Utama et al, 2000. Pada saat pengujian kolorimetri ATPase, fraksi kolom kromatografi
ekstrak biji jintan hitam yang sudah dilarutkan dalam metanol ditambahkan sebanyak 5 µl ke dalam satu well yang sudah terdapat 45 µl master mix.
Sehingga konsentrasi fraksi yang diujikan menjadi 10.000 ppm. Uji kolorimetri ATPase ini melibatkan pengukuran serapan senyawa
organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA helikase. Aktivitas enzim RNA helikase bergantung pada ATP sebagai donor energi. Prinsip ujinya
adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi fosfat anorganik. Pi
bebas akan membentuk kompleks warna dengan pereaksi ammonium molibdat membentuk fosfomolibdat. Fosfomolibdat dapat bereaksi dengan
enzim RNA helikase dan enzim akan mengendap dan menimbulkan kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan kembali enzim yang
terendapkan sehingga tidak menimbulkan kekeruhan. Warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi Pi yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase
dan ATP Chan et al, 1986. Na sitrat digunakan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang mengakibatkan terjadinya warna yang berlebih.
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Selajutnya absorbansi diukur dengan menggunakan multiscan EX pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 nm
adalah serapan optimum dari kompleks fosfomolibdat malachite green hasil reaksi larutan pewarna dengan fosfat bebas hasil hidrolisis ATP yang
menghasilkan warna hijau kebiruan. Sedangkan warna kuning merupakan warna yang dihasilkan oleh larutan pewarna yang tidak berikatan dengan Pi.
Penggunaan dua panjang gelombang bertujuan agar perhitungan reaksi antara enzim dengan substrat lebih akurat. Perhitungan konsentrasi Pi
dihasilkan dengan membandingkan nilai absorbansi dari pembacaan kedua panjang gelombang tersebut Chan et al, 1986.
Gambar 4.2 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji Jintan Hitam Nigella sativa L. terhadap RNA Helikase HCV
Dari diagram hasil uji kolorimetri ATPase menunjukkan fraksi kolom kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam menunjukkan adanya aktivitas
untuk menghambat enzim RNA helikase HCV. Fraksi tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan
oleh fraksi 10, 11 dan 12 yaitu dengan persen inhibisi masing-masing 77,170, 76,381 dan 73,709. Perbedaan aktivitas inhibisi diantara
fraksi-fraksi tersebut tidak jauh dikarenakan masih berada pada gradien
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang sama yaitu dielusi dengan menggunakan eluen n-heksana:etil asetat 9:1.
Terlihat adanya perbedaan dari hasil uji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dari fraksi kolom dengan ekstrak kental yang belum
dipisahkan dimana persentase inhibisi ekstrak kental biji jintan hitam dengan konsentrasi yang sama yaitu 66,935 dengan konsentrasi 10.000
ppm lampiran 15. Hasil fraksi kolom kromatografi memberikan aktivitas yang lebih tinggi, dikarenakan senyawa yang memberikan aktivitas pada
ekstrak biji jintan hitam telah berhasil dipisahkan dari komponen senyawa lain.
Sebaiknya untuk pengerjaan yang lebih efisien, tidak perlu dilakukan pengujian aktivitas inhibisi pada semua fraksi, namun terlebih dahulu
melakukan uji kromatografi lapis tipis KLT terhadap fraksi-fraksi yang diperoleh. Kemudian fraksi yang memiliki spot yang sama digabung, lalu
dilakukan uji aktivitas inhibisi enzim RNA helikase. Dari gambar 4.3 terlihat bahwa fraksi 10 hingga 17 menunjukkan spot yang sama, sehingga
dapat digabung dalam pengujian aktivitas inhibisinya.
Gambar 4.3 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam Nigella sativa L.
4.9 Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV
