14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
3.1.1 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai bulan September 2013.
3.1.2 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, laboratorium Kimia Obat Jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor dan Herbarium
Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong Bogor. 3.2
Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, batang pengaduk, gelas ukur, kertas saring, kapas, lumpang alu, tabung
reaksi, corong, cawan penguap, timbangan analitik, alat penggiling simplisia, inkubator goyang, vortex, tube 50 ml, erlenmeyer, 96-well
microtiter, pipet mikro, neraca analitik, peralatan gelas, microplate reader Multiscan EX, vial, Laminar Air Flow LAF, lemari pendingin, sonikator,
autoklaf, kolom kromatografi, erlenmeyer, gelas beaker, lempeng KLT, chamber.
3.2.2 Bahan Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah biji jintan hitam
Nigella sativa L.. Biji jintan hitam ini diperoleh dari PT Lantabura, Depok. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut n-
heksana, aquadest, nat rium hidroksida, dragendroff’s, mayer’s, asam
hidroklorit, ferri klorida, asam sulfat, kloroform, pereaksi Liebermann- Buchard 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H
2
SO
4
pekat, bakteri
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Escerichia coli BL21 DE3 pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid pET21b koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi
LIPI, media Luria Bertani LB, aquades, ampisilin, IPTG isopropil β-D-
thiogalaktopiranoside, buffer B 10 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl, dan 0,25 Tween 20, resin Talon, dan buffer elusi 400 mM imidazole
dalam buffer B, 0.1 mM ATP Adenosin trifosfat, 0.1 mM MOPS asam 4-morfolinopropana sulfonat, 1 mM MgCl2, larutan hijau malachite, 2.3
polivinil alkohol, amonium molibdat, natrium sitrat, sukrosa, TEMED, akrilamid, amonium persulfat, coomassie brilliant blue, marker protein 250
kDa BIORAD
®
, silika gel, etil asetat, kapas dan alumunium foil. 3.3
Tahapan Penelitian 3.3.1
Persiapan Simplisia Biji jintan hitam diperoleh dari PT Lantabura Depok. Selanjutnya
dilakukan proses penggilingan dan pengayakan menggunakan ayakan 40 mesh untuk diperoleh serbuk halus simplisia biji jintan hitam.
3.3.2 Determinasi Biji Jintan Hitam
Proses determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor.
3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam Nigella sativa L.
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 300 g dan dimasukkan kedalam erlenmeyer. Lalu dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-
heksana sebanyak 900 ml. Proses maserasi didiamkan selama 24 jam, sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung
di dalam erlenmeyer lain dengan cara disaring menggunakan kertas saring. Kemudian serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut n-
heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung kembali dengan cara
disaring menggunakan kertas saring. Serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut n-heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil
sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kembali dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring. Seluruh hasil penampungan maserasi dikumpulkan untuk dilakukan pemekatan
ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator suhu 45⁰C hingga diperoleh ekstrak kental n-heksana biji jintan hitam Nigella sativa L..
3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam Nigella sativa L.
Rendemen ekstrak n-heksana biji jintan hitam total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak n-
heksana biji jintan hitam total yang diperoleh. Rendemen =
3.3.5 Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana biji jintan
hitam Nigella sativa L.. a.
Alkaloid Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asam hidroklorit dan kemudian
disaring. Dilakukan uji pada beberapa pereaksi Tiwari et al, 2011: 1.
Uji Mayer: filtrat ditambahkan dengan pereaksi Mayer kalium merkuri iodida. Maka akan terbentuk endapan berwarna kuning
yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid. 2.
Uji Dragendroff: filtrat ditambahkan pereaksi Dragendroff larutan potassium iodida. Maka akan membentuk endapan merah yang
menunjukkan adanya senyawa alkaloid. b.
Saponin Ekstrak sebanyak 0,5 mg dikocok dalam 2 ml aquades. Jika terbentuk
busa yang cukup lama sekitar 10 menit, menunjukkan adanya senyawa saponin Tiwari et al, 2011.
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
c. Fenol
Ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri klorida. Jika terbentuk warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya senyawa fenol Tiwari
et al, 2011. d.
Tannin Ekstrak sebanyak 0,5 gram dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam
tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan beberapa tetes ferri klorida 0,1 . Terbentuk warna hijau kecoklatan
atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin Ayoola, G.A. et al., 2008.
e. Flavonoid
Larutan ammonia sebanyak 5 ml ditambahkan kedalam filtrat air dari ekstrak, lalu ditambahkan 1 ml asam sulfat. Terbentuk warna kuning
menunjukkan adanya flavonoid Ayoola, G.A. et al, 2008. f.
Triterpenoid dan Steroid Ekstrak sebanyak 0,15 gram dicampurkan ke dalam 2 ml asam asetat
anhidrat CH
3
CO
2
O, kemudian ditambahkan 2 ml H
2
SO
4
1N. Adanya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan
adanya triterpenoid sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid Indrayani, Soetjipto Sihasale, 2006.
g. Terpenoid
Ekstrak sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam 2 ml kloroform, kemudian ditambahkan H
2
SO
4
sebanyak 3 ml. Adanya warna coklat kemerahan menunjukkan adanya terpenoid Ayoola et al, 2008.
h. Minyak atsiri
Ekstrak kental yang berbau enak ditambahkan etanol, selanjutnya larutan alkoholik tersebut diuapkan kembali sampai kering. Jika residu
tetap berbau enak, menunjukkan ekstrak positif mengandung minyak atsiri Indrayani, Soetjipto Sihasale, 2006
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.6 Parameter Standar
a. Susut Pengeringan
Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan kedalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu
105⁰C selama 30 menit dan ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan cara menggoyangkan botol, hingga
membentuk lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika berupa ekstrak kental diratakan dengan batang pengaduk. Kemudian
dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105⁰C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan
botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar Depkes RI, 2000.
b. Kadar Abu
Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dipanaskan pada temperatur 625⁰C dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan
menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan
mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera
dalam monografi Depkes RI, 2000. 3.3.7
Pemisahan Senyawa dengan Kolom Kromatografi Pemisahan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kental biji
jintan hitam Nigella sativa L. menggunakan kolom kromatografi. Kolom yang digunakan berdiameter 2,54 cm dan panjang 65 cm. Kolom
dibersihkan dan disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk menahan silika gel agar tidak keluar, lalu dipasang tegak lurus pada statif.
Kemudian silika gel ditimbang seberat 100 gram dan dilarutkan dengan pelarut organik nonpolar yaitu n-heksana, diaduk hingga terbentuk
suspensi Yazid, 2005. Selanjutnya silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketuk-
ketuk agar silika dapat memadat didalam kolom. Pelarut dimasukkan ke
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dalam kolom dan ditampung, lalu dimasukkan kembali ke dalam kolom. Proses ini dilakukan secara berulang-ulang hingga silika gel menjadi
padat. Ekstrak kental biji jintan hitam seberat 4 gram dilarutkan ke dalam pelarut n-heksana sebanyak 4 ml. Kemudian dimasukkan secara hati-hati
kedalam kolom pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding kolom.
Pemisahan ekstrak kental biji jintan hitam dengan menggunakan elusi pelarut bergradien n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 100:0-
0:100 Eluat ini kemudian ditampung di dalam vial. Masing-masing fraksi elusi diuji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dengan menggunakan uji
ATPase kolorimetri. 3.3.8
Produksi Enzim RNA Helikase HCV Produksi enzim RNA helikase HCV diawali dengan pembuatan
media terlebih dahulu. Media yang dibuat adalah LB Luria Bertani cair untuk Escherichia coli BL21 DE3pLysS. Media LB ini dibuat sebanyak
10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Pembuatan media LB dengan cara mencampurkan Tryptone:NaCl:Yeast ekstrak 2:2:1.
Selanjutnya media ini disterilisasi pada suhu 121⁰C selama 15 menit. Tahap pertama dalam purifikasi RNA helikase HCV adalah
prekultur, yaitu media LB cair 10 ml diberi ampisilin 100 µgml dan dimasukkan ke dalamnya bakteri E.coli BL21 DE3pLysS yang
membawa gen RNA helikase. Lalu diinkubasi dalam inkubator goyang dengan suhu 37⁰C, kecepatan 150 rpm dan dibiarkan semalam.
Tahap selanjutnya
adalah kultur,
yaitu hasil
prekultur diinolukasikan kedalam media LB 400 ml yang sebelumnya telah diberi
ampisilin 100 µgml dan diinkubasi dalam inkubator goyang suhu 37⁰C, 150 rpm selama satu jam. Setelahnya ditambahkan IPTG isopropil
β-D- tiogalakto-piranoside 0,3 mM dan diinkubasi kembali selama 3 jam pada
suhu 37⁰C dan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml, divortex
terlebih dahulu kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
selama 10 menit untuk mendapatkan pelet. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh disimpan pada suhu -20⁰C. Untuk tahap berikutnya,
terlebih dahulu dibuat larutan buffer B yang terdiri dari campuran Tris- HCl 10 mM pH 8,5, Tween 20 0.25 dan NaCl 100 mM. Selanjutnya
dibuat buffer elusi dengan cara mencampurkan imidazol 400 mM kedalam buffer B.
Pelet yang diperoleh dilakukan pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Kemudian dilanjutkan dengan sonikasi pemecahan sel dengan
menggunakan sonikator dengan amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik dilakukan tiga kali dengan interval 1 menit. Selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 7000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tube 50 ml, sedangkan pelet disimpan pada suhu -
20⁰C untuk pengujian SDS PAGE. Supernatan tersebut ditambahkan resin TALON 200 µl dan diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam.
Setelahnya, supernatan disentrifugasi selama 7 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan inner volume yang diperoleh
dipindahkan untuk pengujian SDS PAGE, sedangkan pelet ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml dan diaduk secara perlahan. Kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh dipindahkan washing 1 dan peletnya
ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi kembali selama 3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh washing
2 dipisahkan dari peletnya. Pelet ini dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Kemudian
ditambahkan 400 µl buffer elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu malam. Kemudian pelet tersebut disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan E1Elution 1 yang diperoleh dipindahkan, sedangkan endapannya dicuci dengan 100 µl larutan buffer
elusi dan disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan E2Elution 2 dan resin yang diperoleh dipisahkan dan
disimpan pada suhu 4⁰C.
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE 8
Enzim RNA helikase dianalisa kemurniannya menggunakan metode SDS-PAGE. Plat kaca yang terdiri atas short plate dan spacer
plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70. Short plate ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi
casting frame pada bagian tengah dan dikunci menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel yang terdiri dari 1,5 Tris pH 8.8,
30 Akrilamid, 10 Amonium persulfat dan TEMED. Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate sampai terisi dua
pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh dan ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit.
Setelah terbentuk separating gel, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan bahan-bahan yang terdiri dari 0,5 Tris pH 6.8, 30 Akrilamid,
10 Amonium persulfat dan TEMED. Sebelum larutan gel stacking dimasukkan, aquades pada gel separating dibuang. Kemudian larutan gel
stacking dimasukkan sampai batas atas kaca, lalu comb dipasangkan dan ditunggu selama ± 30 menit hingga gel memadat. Gel dipindahkan dari
casting frame, gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam
clamping frame, dan ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi
dengan working solution buffer elektroforesis SDS 1x pH 8,3. Masing-masing sampel yang akan diuji dengan SDS PAGE 8
yaitu pelet, supernatan, inner volume, washing 1, washing 2, elution 1, elution 2 dan resin diambil 4 µl dan ditambahkan loading dye 10 µl,
kemudian didenaturasi dengan cara dipanaskan di dalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15 menit. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam well
sebanyak 5 µl. Kemudian gel dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining
comassie blue G-250 selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining ± 30 menit
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan 2 kali pengulangan. Setelahnya dibilas dengan aquades hingga bau asam hilang Utama et al, 2000.
3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV
Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Enzim RNA helikase dibuat pengencerannya
terlebih dahulu yaitu 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x. Pengenceran yang dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian pembuatan larutan
master mix yang terdiri dari ddH
2
O, MOPS 0.1 M, MgCl
2
0.1 mM, dan ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan cara mengisi tiap
microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim dan 45 µl master mix. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl master mix.
Pengujian ini dilakukan secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan
penambahan larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 malachite green, H
2
O, 5.7 amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan
pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian
ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Asorbansi hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 405 nm
dan 620 nm Utama et al, 2000. 3.3.11
Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA Helikase HCV
Pengujian aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam Nigella sativa L terhadap enzim RNA Helikase dilakukan berdasarkan metode ATPase
kolorimetri Utama et al, 2000. Ekstrak biji jintan hitam dimasukkan sebanyak 5 µl ke dalam setiap well, lalu ditambahkan 45 µl larutan master
mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl larutan master mix. Untuk
kontrol aktivitas enzim berupa campuran larutan master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim, sedangkan kontrol negatif
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
berupa campuran 5 µl metanol dan 45 µl campuran master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Semua pengujian dilakukan
secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan larutan
pewarna yang terdiri dari 0.081 malachite green, H
2
O, 5.7 amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 polivinil alkohol dengan perbandingan
2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali
selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Absorbansi diukur
pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm menggunakan microplate reader Utama et al, 2000.
Nilai absorbansi yang diperoleh akan digunakan untuk menghitung persentase aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam Nigella sativa L
terhadap RNA Helikase HCV. Persentase inhibisi ekstrak biji jintan hitam terhadap RNA helikase dapat dihitung dengan rumus :
Inhibisi = x 100
Keterangan : A
= absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel. I
= absorbansi enzim RNA helikase dengan penambahan sampel 3.3.12
Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi yang telah diuji
aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase HCV, kemudian dihitung aktivitas RNA helikase dengan menghitung kadar fosfat yang dilepaskan.
Fosfat tersebut terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi fosfat bebas. Perhitungan aktivitas RNA
helikase dilakukan dengan memasukkan nilai absorbansi λ 620nm–405nm
ke dalam persamaan kurva standar fosfat Lampiran 18.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori