27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
geraknya adalah eluen bergradien, yaitu n-heksana:etil asetat dengan berbagai perbandingan 100:0
–0:100. Sampel ekstrak biji jintan hitam yang dimasukkan ke dalam kolom sebanyak 4 ml dengan konsentrasi 1 gml, lalu
dilanjutkan dengan memasukkan eluen n-heksana:etil asetat tersebut. Senyawa yang keluar ditampung sebanyak 4 ml untuk masing masing
fraksi. Seluruh fraksi yang diperoleh kemudian diuapkan dan dilarutkan kembali dengan metanol absolut sehingga konsntrasinya menjadi 100.000
ppm. Fraksi-fraksi ini kemudian diuji aktivitas inhibisinya terhadap enzim RNA helikase HCV dengan metode uji kolorimetri ATPase.
4.6 Produksi Enzim RNA Helikase HCV
4.6.1 Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV
Tahap pertama dimulai dengan prekultur yang dilakukan dalam media cair Luria Bertani LB 10 ml. Media LB ini merupakan media
yang cocok untuk pertumbuhan bakteri karena terdiri dari komponen yang kompleks yaitu tripton, ekstrak khamir, dan natrium klorida. Dalam tahap
prekultur ini ditambahkan antibiotik ampisilin pada media LB yang berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E.coli
BL21DE3 pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten ampisilin. Oleh karena itu, dengan penambahan
ampisilin ini diharapkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain sehingga hanya bakteri E.coli yang membawa gen RNA HCV tersebut
yang dapat tumbuh. Media yang sudah dimasukkan bakteri E.coli tersebut dikultur dalam shaker incubator pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150
rpm selama satu malam Pelzar Chan, 1986. Tahap kedua adalah kultur bakteri E.coli BL21DE3 pLysS-RNA
helikase HCV rekombinan yaitu dengan memindahkan hasil prekultur ke medium LB 400 ml yang sebelumnya telah ditambahkan ampisilin.
Kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm dan Isopropil β-D-thiogalaktopiranosida IPTG ditambahkan pada saat
nilai OD
600
Optical Density kultur sel E.coli mencapai 0,3, karena pada nilai tersebut kultur bakteri mencapai fase logaritmik. Fase ini merupakan
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
fase awal dimana bakteri E.coli tumbuh. Penambahan IPTG tersebut bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase HCV agar terjadi ekspresi
yang berlebih hingga fase awal stasioner dimana nilai OD
600
mencapai 1 Utama et al, 2000.
Kemudian bakteri E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV tersebut dipanen dengan sentrifugasi bertingkat. Sentrifugasi bertingkat ini
bertujuan untuk memisahkan E.coli dari media LB. Proses sentrifugasi dilakukan pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit.
Bakteri E.coli akan mengendap sebagai pelet sedangkan media LB terpisah sebagai supernatan. Pelet yang telah terkumpulkan disimpan pada suhu -
20 C untuk menghindari kerusakan pada sel dan menjaga stabilitas enzim
RNA Helikase HCV.
4.6.2 Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV
