90
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli - Oktober 2007 di Laboratorium Mikrobiota dan Laboratorium Hidrokimia Pusat Penelitian Limnologi LIPI
Cibinong.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri Bacillus megaterium asal Sungai Cisadane yang diperoleh dari hasil isolasi dan telah diidentifikasi pada
kegiatan penelitian sebelumnya di Laboratorium Mikrobiota Pusat Penelitian Limnologi LIPI Cibinong. Media bakteri Nutrient Agar NA dan Nutrient Broth
NB, akuades steril, air demin, alkohol 70, sediaan Hg stok 1000 mgL, H
2
SO
4
pekat, HNO
3
pekat, KMnO
4
5, KperSulfat 5, hidroksilamin klorida 10, dan SnCl
2
10.
Peralatan yang digunakan adalah tabung reaksi pyrex bertutup ulir, rak tabung reaksi, cawan petri berdiameter 9 cm dan tinggi 2 cm, botol Schott 200 ml
dan 2000 ml, gelas ukur 10 ml, gelas Beaker 200 ml, labu Erlenmeyer 200 ml dan 500 ml, kapas, kertas tissu, kertas koran, alumunium foil, kertas saring Whattman
θ=0,2 µm , pipet mikro Gilson dan pipet volumetrik 2 ml, 5 ml dan 10 ml, pipet makro otomatis Socorex 0,5 - 5 ml, pipet mikro eppendorf 50 - 100µL, tip pipet
mikro steril, bulb pipet, spatula, ose, laminar air flow, hot plate with stirrer
91 Nuova, shaker, pompa vakum, timbangan analitik elektrik, autoklaf, inkubator,
botol sampel steril, spektrofotometer DR2010 dan Atomic Absorption Spectrophotometry
AAS Hiranuma Hg-310 Mercury Analyzer.
3.3. Prinsip Percobaan
Penelitian ini merupakan studi eksperimental dengan objek isolat bakteri Bacillus megaterium
. Isolat B. megaterium dengan kemampuan metabolisme yang dimilikinya akan diuji kemampuannya dalam menyerap logam berat Hg dengan
konsentrasi yang berbeda 10, 15 dan 20 mgL dalam media secara triplo dan
dibandingkan dengan kontrol masing-masing perlakuan.
3.4. Metode Kerja 3.4.1. Persiapan Isolat Bakteri
B. megaterium
Peremajaan isolat bakteri B. megaterium dilakukan dengan menggunakan media Nutrient Agar. Isolat diambil sebanyak satu ose, kemudian digores pada
media NA dalam cawan petri dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 28 ˚C.
Pemurnian bakteri dilakukan sampai didapat koloni yang terpisah. Hasil pemurnian diinokulasi ke dalam beberapa media NA pada tabung miring,
berfungsi sebagai working culture dan stock culture.
3.4.2. Persiapan Media
Media NA Nutrient Agar terdiri dari 0,3 gr ekstrak daging, 0,5 gr bakto pepton dan 1,5 gr agar. Media NA dibuat dengan mencampur semua komponen
bahan dengan akuades sesuai volume yang dibutuhkan, kemudian dipanaskan
92 sambil diaduk sampai homogen. Media NB dibuat dengan cara yang sama
namun tanpa agar, kemudian media disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm.
3.4.3. Persiapan Sediaan Larutan Logam Hg Sediaan larutan logam Hg murni dengan konsentrasi 1000 mgL
dikonversi menjadi 10 mgL, 15 mgL dan 20 mgL dengan teknik pengenceran. Untuk mendapatkan volume logam yang harus dimasukkan ke dalam media NB
dalam Erlenmeyer 200 ml sampai mencapai volume total sebesar 40 ml dengan menggunakan rumus persamaan :
V1 = Volume total media dalam Erlenmeyer 40 ml V2 = Volume larutan logam Hg yang akan digunakan ml
N1 = Konsentrasi logam Hg yang ditentukan mgL N2 = Konsentrasi logam Hg yang digunakan 1000 mgL
Perlakuan 1 Logam 10 mgL
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 10 = V2 x 1000
V2 = 40 x 10 = 0,4 ml larutan logam sediaan 1000 mgL 1000
Perlakuan 2 Logam 15 mgL
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 3 = V2 x 1000
V2 = 40 x 15 = 0,6 ml larutan logam sediaan 1000 mgL 1000
Perlakuan 3 Logam 20 mgL
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 3 = V2 x 1000
V2 = 40 x 20= 0,8 ml larutan logam sediaan 1000 mgL 1000
Kontrol :
Media NB yang ditambahkan logam Hg sesuai perlakuan
V1 . N1 = V2 . N2
93 Tabel 1.
Tabel 1. Perlakuan Pemberian Kultur Inokulum dan Sediaan Volume total = 40 ml
Perlakuan Volume Kultur
Inokulum Bakteri yang diberikan
Volume Larutan Logam Hg Sediaan
1 10mgL 4 ml
0,4 ml 2 15 mgL
4 ml 0,6 ml
3 20 mgL 4 ml
0,8 ml
Kontrol Media NB yang ditambahkan larutan logam Hg
sesuai masing-masing perlakuan, tanpa inokulum bakteri
3.4.4. Pembuatan Kurva Tumbuh Isolat Bakteri B. megaterium
Sebanyak satu ose isolat bakteri B. megaterium dalam agar miring working
culture diinokulasi ke dalam 50 ml media NB steril dalam Erlenmeyer, lalu
dihomogenkan dengan dikocok dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 24 jam dengan shaker berkecepatan 100 rpm. Selanjutnya kultur tersebut dimasukkan
sebanyak 20 ml ke dalam 180 ml NB steril kemudian diukur nilai OD Optical Density
sel-selnya dengan panjang gelombang 600 nm menggunakan spektrofotometer. Selain itu, jumlah selnya dihitung dengan metode TPC Total
Plate Count menggunakan spread plate dengan batang L pada cawan petri
secara triplo untuk mengetahui jumlah sel per koloniml pada jam ke 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24. Skema pembuatan pola tumbuh bakteri ditampilkan pada
Lampiran 2.
Pembuatan pola pertumbuhan bakteri B. megaterium bertujuan untuk mengetahui waktu pertumbuhan yang optimum dan masa inkubasi terbaik “tx”
94 yang dapat menunjukkan kecepatan pertumbuhan sel tertinggi persatuan waktu
jam dengan menggunakan rumus kecepatan pertumbuhan µ Fardiaz, 1988:
N0 = jumlah sel awal ml N = jumlah selml setelah waktu t
t0 = waktu awal t = waktu akhir
3.4.5. Persiapan Kultur Inokulum
Sebanyak satu ose isolat Bakteri B. megaterium berumur 24 jam dalam agar miring working culture diinokulasi ke dalam 50 ml media NB steril
dalam Erlenmeyer, lalu dihomogenkan dengan dikocok dan dinkubasi selama 24 jam dengan shaker berkecepatan 100 rpm.
Sebanyak 20 ml inokulum tadi 10 dari volume total media di masukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi media NB sehingga menjadi 200
ml, lalu diinkubasi selama “tx” terbaik atau sampai waktu saat kecepatan pertumbuhan sel bakteri tertinggi dengan shaker berkecepatan 100 rpm. Untuk
selanjutnya kultur cair ini digunakan sebagai biang inokulum.
3.4.6. Uji Kemampuan Biosorpsi oleh Isolat Bakteri B. megaterium
Inokulum isolat bakteri diinokulasi ke dalam media steril NB yang berisi logam Hg dengan konsentrasi perlakuan 10, 15 dan 20 mgL. Volume inokulum
bakteri inokulum biang yang dimasukkan ke dalam setiap Erlenmeyer adalah
µ = 2,303 log N – log N0 t – t0
95 110 10 dari volume total media yang telah ditentukan 40 ml, jadi volume
inokulum bakteri yang dimasukkan ke dalam tiap Erlenmeyer adalah: 110 x 40ml = 4 ml, dengan suhu ruang, shaker berkecepatan 100 rpm dengan waktu
inkubasi setelah bakteri diinokulasikan ke dalam media perlakuan adalah setelah tercapai fase kematian. Kemudian kultur diukur konsentrasi logam Hg yang
tersisa, sehingga dapat diketahui kemampuan biosorpsinya melalui konsentrasi logam Hg yang terserap.
3.4.7. Pengukuran Biosorpsi Logam Hg oleh Isolat B. megaterium
Sampel disaring dengan kertas saring Whattman menggunakan pompa vakum untuk mendapatkan filtrat sampai volume ±10 ml dalam tabung reaksi
bertutup ulir, kemudian cairan filtrat dari setiap perlakuan tersebut ditambahkan 2 tetes HNO
3
pekat dan siap untuk dianalisa logamnya pada AAS. Filtrat yang diperoleh dari hasil pemisahan biomassa isolat diukur
konsentrasi logam Hg-nya untuk mengetahui konsentrasi logam Hg yang tidak terserap oleh B. megaterium yang tersisa di dalam media. Perbedaan
konsentrasi logam awal dengan konsentrasi akhir merupakan konsentrasi logam Hg yang terserap oleh B. megaterium Hancock, 1996.
Pengukuran logam berat Hg pada sampel tersebut dilakukan menggunakan Atomic Absorption Spectrophothometry AAS
dengan nyala udara asetilen pada panjang gelombang 253,7 nm. Pengukuran konsentrasi logam Hg dilakukan
setelah sampel diinkubasi sampai fase kematian. Karena kisaran konsentrasi Hg dalam sampel perlakuan dan sampel
kontrol sekitar 10, 15 dan 20 mgL atau lebih tinggi maka sebelum sampel
96 tersebut diukur konsentrasinya pada instrumen AAS Hiranuma Hg-310 Mercury
Analyzer dilakukan proses digest Lampiran 4, dan dilution pengenceran.
Proses dilution dilakukan agar memungkinkan sampel dapat diukur dalam orde
nano gramL, dilution dilakukan dengan menggunakan automatic micropipette eppendorf 10-100 µgL dan automatic macropipette Socorex 0-5 mL.
Dengan demikian karena sangat sensitif maka proses pemanasan yang terlalu lama konvensional dengan hot plate ± 2 jam pada 95 ºC akan
menyebabkan hilangnya Hg yang telah didisain hanya dalam konsentrasi orde nano gramL yaitu 0 sd 20 nano gramL oleh karena itu, dilakukan modifikasi
metode seperti yang disarankan Csuros dan Csuros 2002 dengan menggunakan autoklaf dengan waktu pemanasan 30 menit.
Rumus jumlah logam Hg yang terserap biosorpsi : Co = konsentrasi awal logam Hg dalam larutan mgL
Ceq = konsentrasi akhir logam Hg dalam larutan mgL Cb = jumlah logam Hg yang terserap mgL
3.4.8. Pengukuran Efisiensi Biosorpsi Logam Hg oleh Isolat B. megaterium
Setelah mengetahui konsentrasi logam Hg yang tidak terserap oleh B. megaterium
yang tersisa di media perlakuan dan konsentrasi akhir logam Hg dalam media kontrol maka dilakukan pengukuran efisiensi biosorpsi oleh
bakteri Joshi, 2003 :
CeqK = konsentrasi akhir logam Hg dalam media kontrol mgL CbP = jumlah logam Hg yang tidak terserap pada perlakuan mgL
Cb = Co - Ceq
R = Ceq K – CbP x 100 Ceq K
97
3.5. Analisa Data
Data yang diperoleh pada penelitian, dianalisa secara statistik menggunakan program SPSS 11.5 dengan cara sebagai berikut :
1. Data hasil pengukuran diolah dengan metode Analisa Sidik Ragam dari Rancangan Acak Lengkap untuk mengetahui perbedaan diantara
perlakuan dengan taraf uji α = 0,05. Perlakuan yang dianalisa adalah
konsentrasi Hg 10 mgL, 15 mgL dan 20 mgL Hg. Kontrol yang digunakan adalah media tanpa Hg. Jika hasilnya berbeda nyata atau
sangat nyata, maka dilakukan uji Duncan Gomez dan Gomez, 1984. H
= Tidak ada perbedaan yang nyata pada efisiensi biosorpsi di antara keempat perlakuan yang diberikan.
H
1
= Ada perbedaan yang nyata pada efisiensi biosorpsi di antara keempat perlakuan yang diberikan.
Tabel 2. Analisa Sidik Ragam RAL
Keragaman Jumlah
Kuadrat db
Rata-rata Kuadrat
F Sig.
Perlakuan Ulangan Galat
Total Dasar penentuan keputusan dilakukan jika :
a. Nilai F
hitung
F
tabel
atau nilai probabilitas sig 0,05 = tidak signifikan, maka H
diterima. b. Nilai F
hitung
F
tabel
atau nilai probabilitas sig 0,05 = signifikan, maka H
ditolak Pratisto, 2004.
98 Optical Density
OD, λ = 600 nm dan populasi bakteri cfuml dianalisa secara
statistik dengan menggunakan uji korelasi Pearson dan menggunakan program Microsoft Excel untuk melihat korelasi di antara keduanya. Jika berkorelasi positif
r ≈ 1, nilai OD dapat digunakan untuk mengetahui umur inokulum untuk
pengujian selanjutnya.
99
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pengamatan Pola Tumbuh Isolat Bakteri B. Megaterium
Hasil pengamatan pola pertumbuhan bakteri B. megaterium dapat dilihat pada Gambar 7. Pada awal inkubasi 0 - 8 jam bakteri memperlihatkan kenaikan
pertumbuhan yang relatif lambat 2,15 x 10
6
cfuml sampai 2,87 x 10
7
cfuml, hal ini dikarenakan bakteri masih dalam fase lag di mana pertumbuhan bakteri sangat
lambat. Populasi sel bakteri meningkat tajam pada jam ke-8 sampai jam ke-12 inkubasi. Pertumbuhan sel tertinggi terjadi pada jam ke-12 inkubasi, yaitu
mencapai 1,73 x 10
9
cfuml dan pertumbuhan sel mengalami penurunan setelah inkubasi melampaui 12 jam.
Pada penelitian ini fase stasioner pertumbuhan bakteri tidak teramati, karena setelah 12 jam inkubasi pertumbuhan sel bakteri sudah menurun tajam, sedangkan
interval sampling adalah 4 jam, namun jika interval sampling dalam pengamatan ini dipersempit maka kemungkinan fase stasioner pertumbuhan bakteri akan dapat
diamati. Setelah lebih dari 12 jam, populasi tampak telah memasuki fase kematian.
Pada fase kematian pertumbuhan sel terhenti dan bakteri sudah menghabiskan energi cadangan ATP untuk respirasinya, sehingga sel bakteri banyak yang mati
Brock dan Madigan, 1991; Volk dan Wheeler, 1993.