91 Nuova, shaker, pompa vakum, timbangan analitik elektrik, autoklaf, inkubator,
botol sampel steril, spektrofotometer DR2010 dan Atomic Absorption Spectrophotometry
AAS Hiranuma Hg-310 Mercury Analyzer.
3.3. Prinsip Percobaan
Penelitian ini merupakan studi eksperimental dengan objek isolat bakteri Bacillus megaterium
. Isolat B. megaterium dengan kemampuan metabolisme yang dimilikinya akan diuji kemampuannya dalam menyerap logam berat Hg dengan
konsentrasi yang berbeda 10, 15 dan 20 mgL dalam media secara triplo dan
dibandingkan dengan kontrol masing-masing perlakuan.
3.4. Metode Kerja 3.4.1. Persiapan Isolat Bakteri
B. megaterium
Peremajaan isolat bakteri B. megaterium dilakukan dengan menggunakan media Nutrient Agar. Isolat diambil sebanyak satu ose, kemudian digores pada
media NA dalam cawan petri dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 28 ˚C.
Pemurnian bakteri dilakukan sampai didapat koloni yang terpisah. Hasil pemurnian diinokulasi ke dalam beberapa media NA pada tabung miring,
berfungsi sebagai working culture dan stock culture.
3.4.2. Persiapan Media
Media NA Nutrient Agar terdiri dari 0,3 gr ekstrak daging, 0,5 gr bakto pepton dan 1,5 gr agar. Media NA dibuat dengan mencampur semua komponen
bahan dengan akuades sesuai volume yang dibutuhkan, kemudian dipanaskan
92 sambil diaduk sampai homogen. Media NB dibuat dengan cara yang sama
namun tanpa agar, kemudian media disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm.
3.4.3. Persiapan Sediaan Larutan Logam Hg Sediaan larutan logam Hg murni dengan konsentrasi 1000 mgL
dikonversi menjadi 10 mgL, 15 mgL dan 20 mgL dengan teknik pengenceran. Untuk mendapatkan volume logam yang harus dimasukkan ke dalam media NB
dalam Erlenmeyer 200 ml sampai mencapai volume total sebesar 40 ml dengan menggunakan rumus persamaan :
V1 = Volume total media dalam Erlenmeyer 40 ml V2 = Volume larutan logam Hg yang akan digunakan ml
N1 = Konsentrasi logam Hg yang ditentukan mgL N2 = Konsentrasi logam Hg yang digunakan 1000 mgL
Perlakuan 1 Logam 10 mgL
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 10 = V2 x 1000
V2 = 40 x 10 = 0,4 ml larutan logam sediaan 1000 mgL 1000
Perlakuan 2 Logam 15 mgL
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 3 = V2 x 1000
V2 = 40 x 15 = 0,6 ml larutan logam sediaan 1000 mgL 1000
Perlakuan 3 Logam 20 mgL
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 3 = V2 x 1000
V2 = 40 x 20= 0,8 ml larutan logam sediaan 1000 mgL 1000
Kontrol :
Media NB yang ditambahkan logam Hg sesuai perlakuan
V1 . N1 = V2 . N2
93 Tabel 1.
Tabel 1. Perlakuan Pemberian Kultur Inokulum dan Sediaan Volume total = 40 ml
Perlakuan Volume Kultur
Inokulum Bakteri yang diberikan
Volume Larutan Logam Hg Sediaan
1 10mgL 4 ml
0,4 ml 2 15 mgL
4 ml 0,6 ml
3 20 mgL 4 ml
0,8 ml
Kontrol Media NB yang ditambahkan larutan logam Hg
sesuai masing-masing perlakuan, tanpa inokulum bakteri
3.4.4. Pembuatan Kurva Tumbuh Isolat Bakteri B. megaterium
Sebanyak satu ose isolat bakteri B. megaterium dalam agar miring working
culture diinokulasi ke dalam 50 ml media NB steril dalam Erlenmeyer, lalu
dihomogenkan dengan dikocok dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 24 jam dengan shaker berkecepatan 100 rpm. Selanjutnya kultur tersebut dimasukkan
sebanyak 20 ml ke dalam 180 ml NB steril kemudian diukur nilai OD Optical Density
sel-selnya dengan panjang gelombang 600 nm menggunakan spektrofotometer. Selain itu, jumlah selnya dihitung dengan metode TPC Total
Plate Count menggunakan spread plate dengan batang L pada cawan petri
secara triplo untuk mengetahui jumlah sel per koloniml pada jam ke 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24. Skema pembuatan pola tumbuh bakteri ditampilkan pada
Lampiran 2.
Pembuatan pola pertumbuhan bakteri B. megaterium bertujuan untuk mengetahui waktu pertumbuhan yang optimum dan masa inkubasi terbaik “tx”
94 yang dapat menunjukkan kecepatan pertumbuhan sel tertinggi persatuan waktu
jam dengan menggunakan rumus kecepatan pertumbuhan µ Fardiaz, 1988:
N0 = jumlah sel awal ml N = jumlah selml setelah waktu t
t0 = waktu awal t = waktu akhir
3.4.5. Persiapan Kultur Inokulum
