15 b.
Produksi Enzim L-asparaginase Produksi L-asparaginase dilakukan dengan menginokulasikan 0.5 mL
suspensi spora dengan kerapatan 10
8
sporamL pada medium Soybean Meal Medium yang terdiri dari 2.25 g tepung kedelai dan 2.25 mL larutan Mineral Mandel dengan
dua kali ulangan pada. Pemilihan Soybean kedelai; Soja max adalah karena medium tersebut adalah medium yang umum digunakan dalam solid state
fermentation selain itu, kedelai memiliki kandungan nutrisi yang lengkap dan asam amino yang tinggi Singhania et al., 2009. Masing-masing kultur produksi
diinkubasi pada inkubator bersuhu 30°C selama 24, 48 hingga 144 jam.
Ekstraksi enzim
ekstrak kasar
L-asparaginase dilakukan
dengan menambahkan 22.5 mL buffer Tris HCl 50 mM dengan pH 8.5 dan dihomogenkan
dengan di shake pada rotary shaker 150 rpm selama 1 jam Gosh et al. 2013. Penggunaan buffer Tris HCl dengan pH 8.5 berdasarkan pernyataan Sinha et al.
2013 bahwa pada umumnya L-asparaginase memiliki stabilitas terbaik pada pH 8 hingga 8.5.
Suspensi kultur produksi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm dan suhu 4
°
C selama 15 menit Ebrahiminezhad et al, 2011. Supernatan yang merupakan enzim ekstrak kasar ditampung dalam botol kaca secara aseptis untuk
penyimpanan dan uji lanjutan. Seluruh prosedur ekstraksi dilakukan on ice untuk mencegah kerusakan protein akibat fluktuasi suhu.
3.4.4 Uji aktivitas Enzim Ekstrak Kasar L-asparaginase
a. Pembuatan Kurva Standart Ammonia
Pembuatan standar amonium dilakukan dengan mereaksikan 100µL ammonium sulfat konsentrasi 5 M, 10 M, 15 M, 20 M, 25 M, 30 M, dan 35
M dengan reagen Nessler sebanyak 200 µL serta 3.7 mL akuades. Campuran tersebut direaksikan selama 20 menit. Pengukuran absorbansi standar amonia tersebut
16 dilakukan dengan panjang gelombang 450 nm. Sebagai blanko, digunakan 100 µL
akuades Kushwaha et al, 2012. Selanjutnya dibuat kurva standar amonium sulfat. Kurva standar tersebut
menunjukkan hubungan antara absorbansi pada =450 nm dengan konsentrasi
ammonium sulfat yang digunakan.
b. Uji Aktivitas L-Asparaginase
Uji kuantitatif aktivitas L-asparaginase dilakukan dengan metode Nesslerisasi amonia yang telah dimodifikasi oleh Singh et al. 2013. Untuk perlakuan test, Crude
enzyme sebanyak 500 µL direaksikan dengan 500 µL L-asparagin 0.04 M dan 500 µL buffer Tris HCl 50 mM pH 8.5, campuran tersebut diinkubasi pada suhu 30°C
selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 500 µL asam trikloroasetat TCA
1.5 M dan didiamkan selama 5 menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 8000 rpm suhu 4°C untuk memisahkan campuran dari
presipitat. Sedangkan pada perlakuan kontrol, L-asparagin 0.04 M direaksikan dengan TCA selama 5 menit, kemudian ditambahkan ekstrak kasar L-asparaginase,
dan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepattan 8000 rpm suhu suhu 4°C untuk memisahkan presipitat.
Sebanyak 100 µL supernatan hasil sentrifugasi direaksikan berturut-turut dengan 200 µL reagen Nessler dan 3700 µL akuades steril. Campuran tersebut
dihomogenkan dan direaksikan selama 20 menit. Kadar amonia test dan kontrol diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm. Aktivitas
enzim UI dinyatakan sebagai jumlah amonia yang dihasilkan mmol oleh 1 mL enzim yang digunakan. UI enzim L-asparaginase ditentukan dengan persamaan
berikut:nnnnnnnnnnnnn
digunakan yang
enzim volume
menit t
mol dilepas
yang ammonia
Jumlah mL
U
inkubasi
17
3.4.5 Karakterisasi Enzim L-asparaginase Singh et al, 2013
