13
3.4.2 Uji Aktivitas L-asparaginase Secara Semikuantitatif
Uji aktivitas L-asparaginase secara semikuantitatif dilakukan dengan menginokulasikan satu jarum inokulum spora kapang endofit pada medium M9
modified yang mengandung indikator phenol red dan diinkubasi padasuhu 30˚C
selama 3×24 jam. Diameter koloni dan zona pink masing-masing isolat diukur untuk menentukan indeks aktivitas enzim dengan persamaan berikut:
Isolat dengan indeks aktivitas terbaik diidentifikasi secara mikroskopis dengan metode slide culture identifikasi mikroskopis dan diremajakan kembali pada
medium PDA miring untuk uji selanjutnya.
3.4.3 Produksi Enzim L-asparaginase Dengan Solid State Fermentation
a. Pembuatan Inokulum
Pembuatan inokulum
ditentukan diawali
dengan pembuatan
pola pertumbuhan kapang endofit berdasarkan penghitungan kepadatan spora sampai
didapatkan jumlah spora 10
8
selml. Mitchell et al, 2000 menyatakan bahwa
Umumnya, teknik fermentasi substrat padat membutuhkan spora dengan kepadatan optimum yakni pada range 10
4
hingga 10
8
SporamL. Namun, kepadatan 10
8
sporamL adalah kepadatan spora yang paling banyak digunakan pada fermetasi substrat padat, karena kepadatan spora inokulum yang terlalu tinggi 10
8
SporamL akan menyebabkan terhambatnya produksi enzim terhambat karena terlalu banyak biomassa mikroba yang tumbuh hingga mereduksi jumlah nutrisi yang
diperlukan untuk memproduksi enzim. Sedangkan jika densitas spora terlalu rendah 10
4
spora mL, biomassa kapang untuk fermentasi tidak mencukupi dan
kemungkinan terjadinya kontaminasi meningkat Rambault, 1980.
Penghitungan kepadatan spora kapang endofit dibuat dengan mengkulturkan spora pada 7 medium PDA miring, kemudian diinkubasi pada inkubator suhu 30°C.
14 Kultur PDA miring diamati kepadatan sporanya setiap hari berturut-turut selama satu
minggu. Pengamatan dilakukan dengan menambahkan 9 mL akuades dengan Tween 80 0.2. sebagai agen dispersi steril pada tiap tabung kultur Higo et al., 2011.
Spora dikerik menggunakan jarum inokulum hingga merata. Suspensi spora yang didapat dipindahkan secara aseptis pada tabung lain. Sebelum pengamatan, suspensi
spora dihomogenkan dengan vortex. 20 µL suspensi spora diteteskan pada bidang hitung haemocytometer Neubauer Gambar 3.1 dan dihitung dengan bantuan
mikroskop. spora yang dihitung adalah spora yang ada pada kotak sedang haemocytometer. Penghitungan dilakukan sebanyak lima kali ulangan.
Gambar 3.1 Bidang hitung penghitungan spora pada haemocytometer
Selanjutnya, Jumlah sporaml sampel ditentukan dengan persamaan berikut BBPPTP Surabaya, 2014:
Keterangan: S
: Jumlah sporaml n
: Rerata spora pada bidang hitung 1, 2, 3, 4, dan 5 L
: Luas bidang hitung kotak t
: kedalaman bidang hitung 0.1 mm d
: Faktor pengenceran
15 b.
Produksi Enzim L-asparaginase Produksi L-asparaginase dilakukan dengan menginokulasikan 0.5 mL
suspensi spora dengan kerapatan 10
8
sporamL pada medium Soybean Meal Medium yang terdiri dari 2.25 g tepung kedelai dan 2.25 mL larutan Mineral Mandel dengan
dua kali ulangan pada. Pemilihan Soybean kedelai; Soja max adalah karena medium tersebut adalah medium yang umum digunakan dalam solid state
fermentation selain itu, kedelai memiliki kandungan nutrisi yang lengkap dan asam amino yang tinggi Singhania et al., 2009. Masing-masing kultur produksi
diinkubasi pada inkubator bersuhu 30°C selama 24, 48 hingga 144 jam.
Ekstraksi enzim
ekstrak kasar
L-asparaginase dilakukan
dengan menambahkan 22.5 mL buffer Tris HCl 50 mM dengan pH 8.5 dan dihomogenkan
dengan di shake pada rotary shaker 150 rpm selama 1 jam Gosh et al. 2013. Penggunaan buffer Tris HCl dengan pH 8.5 berdasarkan pernyataan Sinha et al.
2013 bahwa pada umumnya L-asparaginase memiliki stabilitas terbaik pada pH 8 hingga 8.5.
Suspensi kultur produksi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm dan suhu 4
°
C selama 15 menit Ebrahiminezhad et al, 2011. Supernatan yang merupakan enzim ekstrak kasar ditampung dalam botol kaca secara aseptis untuk
penyimpanan dan uji lanjutan. Seluruh prosedur ekstraksi dilakukan on ice untuk mencegah kerusakan protein akibat fluktuasi suhu.
3.4.4 Uji aktivitas Enzim Ekstrak Kasar L-asparaginase
Kategori