2.7 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR
Pada metode PCR biasa sumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel atau jaringan. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA
melainkan RNA. Sebagaimana kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat rantai tunggal,
sedangkan DNA adalah asam ribonukleat rantai ganda. Ciri khas RNA adalah tidak terdapat gugus basa timin T melainkan diganti oleh urasil U. Pada metode RT-
PCR, pertama-tama RNA diubah dulu menjadi DNA dengan menggunakan enzim reverse transcriptase, yang disebut dengan komplemen DNA cDNA. Dalam hal
ini disintesis cDNA dari perpasangan antara gugus basa U dan A serta G dan C. Dari cDNA inilah dilipatgandakannya segmen DNA yang mirip urutan basa
nukleotidanya dengan RNA, hanya U terganti kembali ke T. Karena adanya penambahan proses sintesis cDNA, tahapan proses PCR
bertambah pula. Tahap pertama terjadi proses annealing untuk memasangkan primer untuk memperpanjang segmen cDNA. Setelah terbentuk segmen cDNA ini,
baru kemudian masuk kepada proses PCR biasa Sopian,2006.
2.8 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul yang terlarut dalam medan listrik akan
bergerak dengan kecepatan tertentu.
30
Elektroforesis melalui gel agarosa merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen DNA. Agarosa disarikan dari
ganggang laut dengan dasar stuktur D-galaktosa dan 3,6-anhidroL –galaktosa. Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dalam bufer dengan pemanasan dan
kemudian dituangkan pada cetakan serta didiamkan sampai dingin. Setelah mengeras, diberikan medan listrik pada kedua ujungnya, maka DNA yang
bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke anoda. Molekul DNA yang lebih besar akan bergerak lebih lambat karena terjadi gesekan lebih besar. Untuk
mendeteksi adanya DNA , sebelum dimasukkan dalan gel agarosa, terlebih dahulu diwarnai dan kemudian dapat dilihat adanya pita molekul pada gel agarosa jika
diletakkan di atas cahaya ultraviolet. Pita molekul ini menandakan adanya segmen DNA Sudjadi,2006.
31
32
BAB III METODE PENELITIAN