18. Alat elektroforesis
19. Mesin PCR merk Bio-rad
20. Alat gel imaging merek Bio-rad
3.3.1 Kerangka Kerja
Pengumpulan Nyamuk Aedes aegypti Ekstraksi RNA virus Dengue
RT-PCR dengan menggunakan primer DEN 1 Elektroforesis
Visualisasi
3.3.2 Ekstraksi RNA Virus Dengue Sebelum melakukan ekstraksi, dilakukan terlebih dahulu persiapan terhadap
bahan-bahan, antara lain :
1. Mempersiapkan Qiagen protease
1,4 bufer AVE ditambahkan ke dalam tabung yang berisi Qiagen protease , dicampur dan dipisahkan ke dalam 5-6 tabung eppendrof, masing-masing
250 µl untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20 C.
2. Mempersiapkan bufer AL
310 µl bufer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi carrierRNA, dicampurkan dan dipisahkan ke dalam 5 tabung eppendrof masing –
masing berisi 62 µl untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20 C.
31
3. Mempersiapkan Bufer AW-1
25 ml etanol 96-100 ditambahkan ke dalam bufer AW-1 dan disimpan pada suhu ruangan.
4. Mempersiapkan Bufer AW-2
30 ml etanol 96-100 ditambahkan kedalam bufer AW-2 dan disimpan pada suhu ruangan
5. Mencampur Medium Virus DMEM Drainase Enrich Medium dimasukkan ke dalam tabung kultur
12 ml sebanyak 9,5 ml per tabung. Lalu ditambahkan 0,5 ml FBS ke
dalam tabung tersebut dan disimpan pada suhu 4
o
C. Adapun cara melakukan ekstraksi RNA virus Dengue dari nyamuk Aedes aegypti
adalah sebagai berikut: Seekor nyamuk dengan menggunakan pinset steril di masukkan ke dalam tabung
eppendorf yang berisi 300 µl medium virus DMEM + FBS, nyamuk kemudian digerus dengan menggunakan penggerus steril. Setelah itu disentrifus dengan
kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4
o
C. Lalu 200µl supernatant hasil sentrifugasi diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang telah diisi 25µl Qiagen protease. Setelah itu ditambahkan 200 µl bufer AL dan diinkubasi selama 15 menit pada
suhu 56
o
C. Lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 250 µl etanol , ditutup dan dicampurkan dengan
menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah divortex, campuran tersebut
32
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Lalu disentrifus lagi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari mesin sentrifus, seluruh campuran tersebut dimasukkan ke dalam column dengan menggunakan mikropipet dan
ditutup , lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah itu column dikeluarkan dari mesin sentrifus lalu collection tube yang mengandung
filtrat dibuang dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian dilakukan berturut-turut pencucian dengan bufer AW-1, bufer AW-2 dan etanol,
dengan cara menambahkan 500 µl masing-masing larutan tersebut, lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari mesin
sentrifus, buang collection tube yang mengandung filtrat dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm
selama 3 menit untuk mengeringkan dry spin. Setelah column dikeluarkan dari mesin sentrifus, buang kembali collection tube
yang mengandung filtrat dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru , tutupnya dibuka dan diinkubasi dalam 56
o
C selama 3 menit. Kemudian masukkan column ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, dimasukkan 100 µl bufer AVE ke
tengah-tengah membran, lalu ditutup dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit.
Setelah itu column dibuang, dan tabung microcentrifuge yang mengandung RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam suhu -70
o
C.
33
3.3.3 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR