Kerangka Kerja Bahan dan Cara Kerja

18. Alat elektroforesis 19. Mesin PCR merk Bio-rad 20. Alat gel imaging merek Bio-rad

3.3.1 Kerangka Kerja

Pengumpulan Nyamuk Aedes aegypti Ekstraksi RNA virus Dengue RT-PCR dengan menggunakan primer DEN 1 Elektroforesis Visualisasi 3.3.2 Ekstraksi RNA Virus Dengue Sebelum melakukan ekstraksi, dilakukan terlebih dahulu persiapan terhadap bahan-bahan, antara lain : 1. Mempersiapkan Qiagen protease 1,4 bufer AVE ditambahkan ke dalam tabung yang berisi Qiagen protease , dicampur dan dipisahkan ke dalam 5-6 tabung eppendrof, masing-masing 250 µl untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20 C. 2. Mempersiapkan bufer AL 310 µl bufer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi carrierRNA, dicampurkan dan dipisahkan ke dalam 5 tabung eppendrof masing – masing berisi 62 µl untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20 C. 31 3. Mempersiapkan Bufer AW-1 25 ml etanol 96-100 ditambahkan ke dalam bufer AW-1 dan disimpan pada suhu ruangan. 4. Mempersiapkan Bufer AW-2 30 ml etanol 96-100 ditambahkan kedalam bufer AW-2 dan disimpan pada suhu ruangan 5. Mencampur Medium Virus DMEM Drainase Enrich Medium dimasukkan ke dalam tabung kultur 12 ml sebanyak 9,5 ml per tabung. Lalu ditambahkan 0,5 ml FBS ke dalam tabung tersebut dan disimpan pada suhu 4 o C. Adapun cara melakukan ekstraksi RNA virus Dengue dari nyamuk Aedes aegypti adalah sebagai berikut: Seekor nyamuk dengan menggunakan pinset steril di masukkan ke dalam tabung eppendorf yang berisi 300 µl medium virus DMEM + FBS, nyamuk kemudian digerus dengan menggunakan penggerus steril. Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Lalu 200µl supernatant hasil sentrifugasi diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang telah diisi 25µl Qiagen protease. Setelah itu ditambahkan 200 µl bufer AL dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 56 o C. Lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 250 µl etanol , ditutup dan dicampurkan dengan menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah divortex, campuran tersebut 32 diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Lalu disentrifus lagi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari mesin sentrifus, seluruh campuran tersebut dimasukkan ke dalam column dengan menggunakan mikropipet dan ditutup , lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah itu column dikeluarkan dari mesin sentrifus lalu collection tube yang mengandung filtrat dibuang dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian dilakukan berturut-turut pencucian dengan bufer AW-1, bufer AW-2 dan etanol, dengan cara menambahkan 500 µl masing-masing larutan tersebut, lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari mesin sentrifus, buang collection tube yang mengandung filtrat dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan dry spin. Setelah column dikeluarkan dari mesin sentrifus, buang kembali collection tube yang mengandung filtrat dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru , tutupnya dibuka dan diinkubasi dalam 56 o C selama 3 menit. Kemudian masukkan column ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, dimasukkan 100 µl bufer AVE ke tengah-tengah membran, lalu ditutup dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Setelah itu column dibuang, dan tabung microcentrifuge yang mengandung RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam suhu -70 o C. 33

3.3.3 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR

Dokumen yang terkait

Deteksi Dan Penentuan Virus Gengue Serotpe 1 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Shain Reaction

0 43 61

Deteksi Dan Penentuan Virus Dengue Serotipe 3 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

1 39 65

Deteksi Dan Penentuan Serotipe Virus Dengue Tipe 4 Dari Nyamuk Aedes Aegypti Dengan Menggunakan Metode Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr) Di Kota Medan

2 68 68

Deteksi Dan Penentuan Serotipe Virus Dengue Tipe-3 (Den-3) Dari Nyamuk Aedes Aegypti Dengan Menggunakan Reverse Transcriptase- PCR (RT-PCR) Di Kota Medan

1 52 82

Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction

0 13 80

Deteksi diferensial Tomato chlorosis virus (ToCV) dan Tomato infectious chlorosis virus (TICV) dengan reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR)

0 10 41

Deteksi cepat virus avian influenza dengan anigen dan penentuan subtipe H5 menggunakan reverse transcription-PCR(Polymerase chain reaction)

1 11 30

Deteksi diferensial Tomato chlorosis virus (ToCV) dan Tomato infectious chlorosis virus (TICV) dengan reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

0 5 80

Deteksi virus avian influenza (h5n1) pada unggas air di propinsi lampung dengan uji haemagglutination inhibition (hi) dan reverse transcriptase polymerase chain reaction (rt pcr)

0 4 50

Deteksi Virus Dengue dari Nyamuk Vektor Aedes aegypti di Daerah Endemik Demam Berdarah Dengue (DBD) di Kota Padang dengan Metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

1 3 15