CO
2
5 pada suhu 37
o
3.11 Analisis Hasil
C. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N, lalu plate dibungkus dengan alumunium foil agar tidak
tembus cahaya pada suhu kamar dan dibiarkan selama satu malam. Sel yanghidup bereaksi dengan MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium
bromide membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibacadengan ELISA reader
pada panjang gelombang 595 nmNugroho, et al., 2012.
Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik sel dikonversikan ke
dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:
Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan IC
50
3.12 Selectivity IndexIndeks Selektivitas
konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel yang dianalisis dengan analisis probit menggunakan
SPSS CCRC, 2009.
Indeks selektivitasmerupakan rasio IC
50
sel normal sel Veroyang dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Sel Vero berasal dari ginjal monyet
hijau afrika Vervet. Untuk memperoleh nilai selectivity index digunakan metode MTT. Sel Vero ditanam pada 96-well plate sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu media kultur diganti dengan media yang baru kemudian
ditambahkan larutan uji dengan berbagai konsentrasi dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang, kemudian sel dicuci dengan PBS. Pada masing-masing sumuran,
Universitas Sumatera Utara
ditambahkan 100μL media kultur dan 10μL MTT 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO
2
5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak
tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Nugroho, et al.,
2012. Indeks selektivitas dihitung menggunakan rumus:
Indeks selektivitas = IC50 Sel Vero
IC50 Sel T47D
3.13 Pengamatan Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri Menggunakan Propidium Iodida
. SelT47D ditanamke dalam tabung6-well platedengankepadatan 1x
10
6
selsumuran. Diinkubasi selama 12 jam dalam inkubator CO
2
5. Setelah itu ditambahkanlarutan ujifraksi air EEKBPT dengan konsentrasi IC
50
dan ½ IC
50
, doksorubisin digunakan sebagai kontrol positif dengan konsentrasi yang sama
,
lalu diinkubasi selama 24 jam. Keesokan harinya sel pada masing-masing sumuran dikumpulkan ke dalam tabung konikel.Kemudian dicuci 2 kali dengan
PBS masing-masing 500 µl. Hasil pencucian dikumpulkan ke dalam tabung konikel di atas.Plate diamati di bawah mikroskop inverted untuk memastikan
tidak ada lagi sel yang melekat di dinding sumuran. Karena ada sel yang masih melekat maka sel dilepaskan menggunakan Tripsin-EDTA 0,025 dan diinkubasi
selama 5 menit. Sel yang terlepas kembali dikumpulkan ke dalam tabung konikel. Kemudian konikel disentrifugasidengan kecepatan200rpm selama 5menit, pelet
sel dipindahkan ke dalam tabung polytube.Pelet sel diresuspensi dengan 300 µL propidium iodida. Campuran diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit,
Universitas Sumatera Utara
kemudian dianalisis menggunakan flowcitometer FACSCalibur Rannali, et al., 2003.
3.14 Uji Penekanan Ekspresi Enzim COX-2 Dengan Metode Imunositokimia
Sebelum sel T47D ditanam terlebih dahulu dimasukkan coverslipterlebih dahulu. Sel sebanyak 5x10
4
sumuran didistribusikan ke dalam plat 24 sumuran yang telah dilapisi coverslip pada bagian dasarnya, kemudian diinkubasi untuk
pengadaptasian sel. Sel diberi perlakuandengan fraksi air EEKBPT dan doksorubisindengan konsentrasi IC
50
dan ½ IC
50
, diinkubasi selama 24 jam. Pada akhir waktu inkubasi, sel dicuci dengan PBS kemudian ditambahkan metanol
dingin, dilanjutkan inkubasi dalam freezer -4
o
C selama 10 menit. Setelah itu, metanol dibuang dan coverslip yang memuat sel diletakkan pada dish bersih. Sel
yang telah difiksasi dengan metanol kemudian dicuci dengan akuades 3 kali dan diinkubasi dengan larutan hidrogen peroksida blocking selama 10 menit pada
temperatur kamar kemudian dibuang. Sel tersebut kemudian diinkubasi dengan prediluted blocking serum selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian dibuang.
Setelah inkubasi, antibodi COX-2 ditambahkan pada sel kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Coverslip kemudian dicuci dengan PBS dan
ditetesi antibodi sekunder biotinylated universal secondary antibody dan selanjutnya diinkubasi selama 10 menit. Sel dicuci kembali menggunakan PBS
kemudian ditetesi denganstreptavidin-enzim horse radish peroxidase dan diinkubasi selama 10 menit. Sel dicuci kemudian ditambahkan 3,3’-
diaminobenzidinDAB, selanjutnya diinkubasi selama 5 menit sampai warna coklat. Sel dicuci lagi dengan PBS dan akuades kemudian dengan larutan Mayer-
Haematoksilin dan diinkubasi selama 5 menit, selanjutnya sel dicuci kembali
Universitas Sumatera Utara
menggunakan akuades sampai bersih, ditambahkan etanol 70 inkubasi selama 2 menit, bersihkan, celupkan kedalam larutan xylol dan keringkan. Setelah kering,
coverslip diletakkan di atas kaca obyek kemudian ditetesi mounting media serta ditutup dengan slide. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop yang dilengkapi
dengan optiLab Cho, et al., 2009.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Pusat Penelitian Botani- LIPI menunjukkan bahwa sampel kulit batang berasal dari pohon Tanjung
Mimusops elengi L. dari suku Sapotaceae. Hasil identifikasi dan Gambar sampel dapat dilihat pada Lampiran 1 dan Lampiran 2.
4.2 Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung EEKBPT
Pemeriksaan makroskopik simplisia KBPTdiperoleh simplisia yangtipis, sukar dikelupas, permukaan tidak rata, berwarna merah hingga coklat muda pada
permukaannya, kulit mudah dipatahkan, dan bekas patahan berwarna coklat keputihan.
Pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia KBPT menunjukkan adanya butir-butirpati dan kristal oksalat berbentuk prisma, serabut, jaringan gabus, dan
parenkim dengan hablur kristal oksalat dan saluran getah. Menurut Depkes RI 2000, standarisasi suatu simplisia merupakan
pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan obat dan menjadi penetapan nilai untuk berbagai parameter produk. Simplisia yang akan digunakan sebagai bahan
baku obat harus memenuhi persyaratan yang tercantum dalam monografi terbitan resmi Departemen Kesehatan Materia Medika Indonesia. Hasil pemeriksaan
karakterisasi simplisia KBPT dan EEKBPT ditunjukkan pada Tabel 4.1 dan 4.2.
Universitas Sumatera Utara
