sediaan obattidak stabil, selain itu bakteri dan jamur cepat tumbuh, dan bahan aktif yang terkandung didalamnya dapat terurai.
Hasil penetapan senyawa larut air untuk simplisia dan ekstrak diperoleh 15,58 dan 64,81. Senyawa larut etanol 20,84 dan 64,15. Penetapan kadar
sari larut dalam air dan etanol dilakukan untuk mengetahui banyaknya senyawa polar yang larut dalam air dan etanol.Penetapan kadar abu total dari serbuk
simplisia dan EEKBPT berturut-turut adalah 3,23 dan 1,01,serta kadar abu tidak larut asam 1,54 dan 0,06. Penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak
larut asam ditetapkan untuk melihat kandungan mineral ekstrak. Zat ini dapat berasal dari senyawa oksida-oksida anorganik. Kadar abu total yang tinggi
menunjukkan adanya zat anorganik logam-logam Ca, Mg, Fe, Cd dan Pb yang sebahagian mungkin berasal dari pengotoran. Kadar logam berat yang tinggi dapat
membahayakan kesehatan, oleh sebab itu perlu dilakukan penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam untukmenjaminan ekstrak tidak mengandung
logam berat tertentu melebihi nilai yang ditetapkan karena berbahaya toksik bagi kesehatan.
4.3 Ekstraksi
Ekstraksi serbuk simplisia KBPT dilakukan secara perkolasi. Ekstraksi dihentikan setelah warna perkolat putih jernih serta memberikan hasil negatif
dengan pereaksi FeCl
3
. Berat ekstrak etanol yang diperoleh adalah sebesar 113,127 g dari 400 g serbuk simplisia yang diekstraksi. Kemudian diambil 20 g
untuk selanjutnya dilakukan ekstraksi cair-cair ECC untuk mendapatkan fraksi nonpolar, semipolar, dan polar menggunakan pelarut n-heksana dan etilasetat.
ECC dimulai dari penambahan air yang bertujuan untuk memperjelas batas
Universitas Sumatera Utara
pemisahan antara dua pelarut. Setelah itu ditambahkan pelarut nonpolar hingga pelarut semipolar n-heksana-etilasetat. Pemisahan ini bertujuan untuk
memisahkan senyawa kimia yang terdapat pada EEKBPT berdasarkan tingkat kepolarannya. Senyawa polar akan larut didalam pelarut polar dan senyawa
nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar. Hasil ECC EEKBPT diperoleh fraksi n-heksana sebanyak 800,161 mg; ekstrak etilasetat 8,138 g; dan fraksi air sisa
sebanyak 8,668 g. Fraksi n-heksana hanya diperoleh dalam jumlah yang cukup kecil, sedangkan fraksi etilasetat dan fraksi air sisa diperoleh dalam jumlah yang
hampir sama. Ini diduga karena di dalam EEKBPT hanya mengandung sebagian kecil senyawa yang bersifat nonpolar dibandingkan dengan senyawa-senyawa
yang bersifat semipolar dan polar. Penggunaan pelarut n-heksana untuk menarik senyawa kimia nonpolar, seperti triterpenoid dan steroid bebas. Pelarut etilasetat
digunakan agar senyawa kimia yang bersifat semipolar dan agak polar tersari di dalamnya, seperti flavonoid, glikosida, antrakuinon glikosida dan tanin.
Sedangkan di dalam fraksi air sisa akan tertinggal beberapa senyawa kimia yang tidak dapat ditarik oleh kedua pelarut di atas seperti saponin, dan glikosida.
Steroidtriterpenoid tersusun dari rantai panjang hidrokarbon yang menyebabkan sifatnya menjadi nonpolar dan mudah terekstraksi dalam pelarut n-
heksana nonpolar yang juga memiliki rantai hidrokarbon Harborne, 1987. Semuasaponinbersifat polardi alam danbebas larut dalamair tetapilarut
dalampelarutnonpolar. Padahidrolisis
akanmenghasilkan suatuaglikonyang dikenal sebagai sapogenin
Flavonoid secara umum larut dalam pelarut semipolar seperti etilasetat. Flavonoid yang terlarut dalam fraksi air kemungkinan merupakan flavonoid
danglikondikenal sebagaigula Negi, et al., 2013.
Universitas Sumatera Utara
glikosida. Adanya gula yang terikat pada flavonoid bentuk umum yang ditemukan cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air.
Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, danflavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti
eter dan kloroform. Flavonoid glikosida tidak larut dalam n-heksana, petroleum eter, kloroform, eter; sedikit larut dalam etil asetat dan etanol; serta sangat larut
dalam air Markham and Andersen, 2006. 4.4Hasil Skrining Fitokimia Fraksi EEKBPT
Skrining fitokimia fraksin-heksana, etilasetat, dan air EEKBPT dilakukan untuk mendapatkan informasi golongan senyawa metabolit sekunder yang terlarut
di dalam masing-masing fraksi yang berbeda kepolarannya. Hasil skrining tersebut selanjutnya dijadikan acuan untuk mengidentifikasi golongan senyawa
mana yang mempunyai aktivitas terhadap sel kanker payudara T47D. Hasil skrining fitokimia fraksidari EEKBPT ditunjukkan pada Tabel 4.3.
Tabel 4.3 Hasil skrining fitokimia fraksi EEKBPT
No Skrining
Pereaksi Fraksi
n-heksana fraksi
etilasetat Fraksi
air 1
Alkaloid Dragendorff
Bouchardat Mayer
- -
- 2
Flavonoid Zn + asam klorida
pekat -
+ +
3 Glikosida
Molish -
+ +
4 Saponin
air panasdikocok -
- +
5 Antrakuinon
glikosida NaOH
- -
- 6
Tanin FeCl
3
- 1
+ -
7 Triterpenoid
Steroid Liebermann-
Burchard +
- -
Keterangan : + = mengandung golongan senyawa, - = tidak mengandung golongan senyawa
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan pengamatan pengujian alkaloid menunjukkan hasil negatif karena pada penambahan pereaksiMayer, Bouchardat, dan Dragendorf tidak
terbentuk endapan, hanya menghasilkan larutan jernih pada penambahan pereaksi Mayer, warna kuning pada penambahan pereaksi Bouchardat dan warna coklat
pada pereaksi Dragendorf.Penambahan serbuk Zn dengan asam klorida pekat memberikan warna merah pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya
senyawa flavonoid. Glikosida menujukkan hasil positif karena terbentuk cincin ungu dengan
penambahan pereaksi Molisch dan asam sulfat pekat. Pereaksi Molisch adalah pereaksi umum yang digunakan untuk identifikasi karbohidrat gula.
Skrining saponin menghasilkan busa yang stabil dengan tinggi busa 7 cm dan tidak hilang dengan penambahan HCl 2 N. Sifat busa saponin disebabkan
adanya struktur amfifilik saponin yang mengakibatkan sifat fisika saponin sebagai surfaktan. Penambahan HCl 2 N akan mengakibatkan kestabilan busa semakin
lama sesuai dengan sifat sabun. Penambahan pereaksi FeCl
3
memberikan warna larutan kuning jernih yang berubah menjadi hijau kehitaman mengindikasikan adanya tanin. Warna
merah yang terjadi pada penambahan pereaksi Lieberman-Burchard menunjukkan adanya senyawa steroidtriterpenoid. Pemeriksaan glikosida antrakuinon akan
terbentuk pada lapisan benzen berwarna kuning menunjukkan adanya antrakuinon dalam bentuk aglikonnya. Dalam penelitian ini uji terhadap adanya glikosida
antrakuinon memberikan hasil yang negatif.
Universitas Sumatera Utara
4.5Uji Sitotoksik dan Penentuan Indeks Selektivitas Ekstrak Etanol dan Fraksi EEKBPT Terhadap Sel T47D dan sel Vero Sel normal
Uji sitotoksik merupakan suatu parameter pendahuluan untuk mengetahui potensi ketoksikan suatu bahan uji terutama sel kanker yang dinyatakan dengan
parameter IC
50
. Namun uji sitotoksik juga dapat dilakukan untuk menilai toksisitas suatu bahan uji terhadap sel normal, sehingga dapat diketahui
keselektivitasannya terhadap sel kanker. Karena suatu senyawa antikanker yang baik harus mempunyai aktivitas membunuh atau menghambat sel kanker tanpa
mengganggu fungsi sel normal. Dalam penelitian ini bahan uji berupa ekstrak etanol, dan beberapa fraksi EEKBPT, yaitu fraksi n-heksana, etilasetat dan air
sisa. Tujuan pengujian fraksi tersebut untuk mendapatkan nilai IC
50
yang lebih kecil dari nilai IC
50
ekstrak etanol.Selain itu pengujian bertujuan untuk mendapatkan hasil akhir fraksi mana yang paling aktif untuk selanjutnya
digunakan sebagai bahan uji lanjutan aktivitas antikanker. Dalam penelitian ini EEKBPT kembali diuji terhadap sel T47D. Pada penelitian sebelumnya telah
diketahui bahwa nilai IC
50
EEKBPT adalah 112,800 µgml. Tetapi perbedaan waktu pengujian dan perbedaan tempat asal sampel uji kemungkinan berpengaruh
terhadap nilai IC
50
Perlakuan uji sitotoksik pada penelitian ini dilakukan terhadap sel kanker payudara T47D dan sel normal Vero dengan menggunakan ekstrak etanol,
fraksi n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi air sisa KBPT dengan seri kadar yang sama, yaitu 15,125 µgml; 31,25 µgml; 62,5 µgml; 125 µgml; dan 250
µgml. Efek ditunjukkan dengan nilai absorbansi Lampiran 17 dan 18, kemudian EEKBPT, maka peneliti merasa penting untuk kembali
melakukan uji sitotoksik terhadap EEKBPT.
Universitas Sumatera Utara
dianalisis menggunakan analisis probit pada program SPSS 17, maka diperolehIC
50
Tabel 4.4 Nilai IC
masing-masing sampel uji seperti ditunjukkan padaTabel 4.4.
50
No masing-masing sampel uji
Sampel Nilai IC
50
Indek selektivitas dalam µgml
Sel T47D Sel Vero
1 Ekstrak etanol
168,243 417,882
2,484 2
Fraksi n-heksana 5796,218
10627,882 1,834
3 Fraksi etilasetat
398,236 302,087
0,759 4
Fraksi air sisa 145,068
599,132 4,130
Berdasarkan Tabel 4.4 di atas, aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D yang
ditunjukkan dengan nilai IC
50
pada perlakuan dengan EEKBPT yaitu 168,243 µgml; fraksi n-heksana 5796,218 µgml; fraksi etilasetat 398,236 µgml; dan
fraksi air 145,068 µgml. Pada perlakuan dengan sampel uji fraksi air menunjukkan nilai IC
50
terkecil, sedangkan fraksi n-heksana menunjukkan nilai IC
50
terbesar. Oleh karena itu, fraksi air dapat dikatakan memiliki aktivitas antikanker paling aktif karena dengan nilai IC
50
yang terkecil sudah mampu menghambat 50 pertumbuhan sel T47D. Berdasarkan nilai tersebut fraksi air
kurang aktif sebagai antikanker karenasuatu ekstrak dianggap aktif jika memiliki nilai IC
50
≤ 100 µgml Kamuhabwa, 2000, namun masih dapat dikembangkan sebagai antikanker karena suatu ekstrak dianggap tidak aktif jika nilai IC
50
Kemampuan fraksi air menghambat pertumbuhan sel kanker diduga karena kandungan senyawa kimia di dalamnya. Jika merujuk pada skrining
fitokimia menunjukkan bahwa fraksi air EEKBPT mengandung golongan 500
µgml Machana, 2011,
Universitas Sumatera Utara
senyawa saponin dan flavonoid. Senyawa flavonoid menghambat proliferasi sel berbagai sel kanker pada manusia melalui inhibisi proses oksidatif yang dapat
menyebabkan inisiasi kanker. Mekanisme ini diperantarai penurunan enzim xanthin oksidase, Cyclooxygenase COX dan Lipooxygenase LOX yang
diperlukan dalam proses prooksidasi sehingga menunda siklus sel. Flavonoid juga menghambat ekspresi enzim topoisomerase I dan II yang berperan dalam
mengkatalisis pemutaran DNA. Inhibitor enzim topoisomerase akan menstabilkan kompleks topoisomerase dan menyebabkan DNA terpotong dan mengalami
kerusakan Ren, et al., 2003. Golongan senyawa lain yang terkandung pada fraksi air yang diduga juga
mempunyai aktivitas antikanker adalah saponin. Saponindapat mengenaliselkanker, karenaselkanker memilikimembran sel danstruktur yang
berbeda dari sel normal. Membran sel kankermengandung lebih banyak senyawa seperti kolesterol. Saponin dapatmengikatkolesterol yang terdapat pada membran
sel kanker, sehingga mengganggu permeabilitas membranSung, et al., 1995.Saponin juga mengurangiterjadinyaspesies oksigen reaktif sepertiH
2
O
2
serta menghambat jalur sinyal fosfatidil-inositol-3 kinaseyang mungkinmenjadi
alasanuntuk pencegahankerusakan kromosom Berdasarkan Tabel 4.4 di atas juga dapat dilihat nilai IC
Pawar dan Bhutani, 2001
50
masing-masing sampel uji terhadap sel Vero sel normal, yaitu EEKBPT 417,882 µgml; fraksi
n-heksana 10627,882 µgml; fraksi etilasetat 302,087 µgml; serta fraksi air 599,132 µgml. fraksi n-heksana menunjukkan nilai IC
50
terbesar, sedangkan EEKBPT menujukkan nilai IC
50
terkecil.Semakin besar nilai IC
50
suatu sampel uji
Universitas Sumatera Utara
terhadap sel normal maka semakin lemah aktivitasnya dalam mempengaruhi pertumbuhan sel tersebut. Hal itu berarti semakin tinggi pula nilai keamanannya.
Suatu produk obat dari bahan alam harus memenuhi persyaratan yaitu aman, berkhasiat, dan bermutu, termasuk obat antikanker WHO, 2000. Selain
itu, obat antikanker harus selektif hanya terhadap sel kanker. Penentuan selektivitas suatu senyawa antikanker didasarkan pada index selektivitasnya atau
selectivity index. SI selectivity index mengindikasikan selektivitas sitotoksik keamanan ekstrak terhadap sel kanker versus sel normal, dihitung dengan
membandingkan IC
50
ekstrak terhadap sel normal dan IC
50
4.6 Uji Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri
