terhadap sel normal maka semakin lemah aktivitasnya dalam mempengaruhi pertumbuhan sel tersebut. Hal itu berarti semakin tinggi pula nilai keamanannya.
Suatu produk obat dari bahan alam harus memenuhi persyaratan yaitu aman, berkhasiat, dan bermutu, termasuk obat antikanker WHO, 2000. Selain
itu, obat antikanker harus selektif hanya terhadap sel kanker. Penentuan selektivitas suatu senyawa antikanker didasarkan pada index selektivitasnya atau
selectivity index. SI selectivity index mengindikasikan selektivitas sitotoksik keamanan ekstrak terhadap sel kanker versus sel normal, dihitung dengan
membandingkan IC
50
ekstrak terhadap sel normal dan IC
50
4.6 Uji Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri
ekstrak terhadap sel kanker. Ekstrak dikatakan selektif tinggi apabila nilai SI 3 Machana, 2011.
Berdasarkan Tabel 4.4 diatas nampak bahwa fraksi air memiliki SI yang paling tinggi yaitu 4,130; diikuti ekstrak etanol 2,484, fraksi n-heksana 1,834; dan fraksi
etilasetat 0,759. Maka dapat disimpulkan bahwa fraksi air memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D tanpa mempengaruhi pertumbuhan
sel normal sel Vero. Oleh sebab itu, berdasarkan alur dan metode penelitian maka fraksi air dijadikan sebagai sampel uji untuk pengujian antikanker lanjutan.
Pada penelitian ini pengamatan siklus sel dilakukan dengan metode flowsitometri dan sebagai pembanding positifnya digunakan doksorubisin yang
merupakan agen kemoterapi yang sering digunakan sebagai pengobatan kanker payudara. Berdasarkan hasil orientasi diperoleh nilai IC
50
doksorubisin sebesar 1,8 µgml. Profil siklus sel T47D dan distribusi sel T47D setelah perlakuan dapat
dilihat pada Gambar 4.1 dan Tabel 4.5.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.1 Profil siklus sel T47D kontrol
Gambar 4.2 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air dengan
konsentrasi IC
50
Gambar 4.3 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air dengan
konsentrasi ½ IC
50
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.4 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan doksorubisin dengan
konsentrasi IC
50
Gambar 4.5 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air dengan
konsentrasi ½ IC
50
.
Tabel 4.5 Akumulasi sel T47D setelah pemberian sampel pada masing-masing
fase siklus sel
Perlakuan Konsentrasi
Fase Siklus Sel G
-G S
1
G
2
-M
Kontrol -
47,49 27,78
20,72 Fraksi Air
IC 18,98
50
17,59 58,91
Fraksi Air ½ IC
36,68
50
10,10 41,80
Doksorubisin IC
44,40
50
21,43 30,19
Doksorubisin ½ IC
53,10
50
20,24 23,44
Universitas Sumatera Utara
BerdasarkanGambar 4.1 dan Tabel 4.5, kelompok kontrol menunjukkan akumulasi sel T47D pada fase G
-G
1,
S dan G
2
-M berturut-turut47,49; 27,78; dan 20,72. Setelah pemberian fraksi air EEKBT dengan konsentrasi IC
50
terjadi peningkatan akumulasi sel pada fase G
2
-M menjadi 58,91, sedangkan pada fase G
-G
1,
dan S terjadi penurunan yaitu 18,98 dan 17,59. Hal yang sama juga ditunjukkan pada perlakuan fraksi air dengan konsentrasi ½ IC
50,
dimana akumulasi sel terbesar juga terjadi pada fase G
2
-M yaitu sebesar 41,80
.
Sehingga dapat dikatakanbahwamekanisme penghambatan siklus sel fraksi air EEKBPT adalah pada fase G
2
Berdasarkan Gambar 4.1 dan Tabel 4.5, pemberian doksorubisin dengan konsentrasi IC
-M.
50
menunjukkan peningkatan akumulasi sel T47D pada fase G
2
-M menjadi 30,19. Ketika konsentrasi doksorubisin diturunkan menjadi ½ IC
50
akumulasi sel pada fase G
2
-M juga mengalami penurunan, tetapi masih lebih tinggi dibandingkan kontrol sel. Kenaikan justru terjadi pada fase G
-G
1
yaitu 53,10. Perubahan fase tersebut diduga berkaitan dengan konsentrasi. Namun,
secara keseluruhan dapat disimpulkan mekanisme penghambatan siklus sel doksorubisin memiliki mekanisme yang sama dengan fraksi air EEKBPT yaitu
pada fase G
2
-M. Temuan ini sesuai dengan hasil penelitian Meiyanto, dkk., 2011, yang menyebutkan doksorubisin memiliki aktivitas menghambat siklus sel
T47D pada fase G
2
-M. Checkpoint pada fase G
2
-Mmerupakan target potensialterapi kanker. KetikaDNA selrusakmemasukimitosis. Checkpointpada G
2
akan mengendalikansel masukdariG
2
ke faseM. Ikatan kompleks antara Cdk1cdc2 Cyclin dependent kinasedenganCyclinB1diperlukan
untukperkembangan dariG
2
kefaseM.
Universitas Sumatera Utara
Ikatankomplekscdc2-B1 melibatkanpenghambatan
fosfatpadasepasangasamaminoaktifolehWee1. Defosforilasiolehenzim cdc25C cell division cycle 25 homolog C
fosfataseakan meningkatkan aktivitas ikatancdc2-B1. Pada saat terjadi kerusakanDNA,Chk1 checkpoint kinase-
1menginaktivasicdc25C menyebabkanikatan cdc2-
Berdasarkan hasil pengamatan diduga mekanisme fraksi air EEKBPT yaitu menghambat Cyclin B1, cdc2, dan cdc25Cyang merupakan protein
pentingterkait dengan fase G B1 menjadi inaktif sehingga
sel gagal untuk masuk ke fase mitosis sehingga mengalami apoptosis Dipaola, 2002.
2
-M. Hal ini kemungkinan diperantarai oleh kandungan senyawa kimia flavonoid di dalam fraksi air EEKBPT. Pada penelitian
melihat ekspresi protein yangmengatur transisi fase G
2
4.7Uji Penekanan Ekspresi Enzim Cyclooxygenase-2 COX-2Dengan Media
Sel T47D
-M dengan metode Western blot, flavonoid menunjukkan penurunan level protein Cyclin B1,
cdc2,dan cdc25c bergantung dosis Lee, et al., 2012.
Pengamatan uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dilakukan dengan cara imunnositokimia.Ekspresi COX-2 hanya dianalisis secara kualitatif menggunakan
mikroskop cahaya karena jumlah sel yang dapat dihitung tidak memadai untuk dianalisis secara kuantitatif. diduga ketika diberi perlakuan banyak sel yang mati
sehingga sel tidak melekat pada kaca objek saat dipreparasi. Hasil pengamatan penekanan ekpresi enzim COX-2 dapat dilihat pada Gambar 4.2.
Universitas Sumatera Utara
a b
c d
e
: ekspresi + : ekspresi -
Keterangan: a kontrol sel T47D b perlakuan sampel dengan konsentrasi IC
c perlakuan sampel dengan konsentrasi ½ IC
50
d perlakuan doksorubicin dengan konsentrasi IC
50 50
e perlakuan doksorubicin dengan konsentrasi ½ IC
50
Berdasarkan analisis secara kualitatif dapat terlihat bahwa kontrol a yang diberikan antibodi COX-2 memberikan warna coklat. Ini sesuai dengan literatur
yang menyebutkan sel bahwa yang mengekspresikan protein tertentu akan berwarna coklatgelap, sedangkan yang tidak akan berwarna ungubiru Meiyanto,
Gambar 4.6
Hasil Pengamatan ekpresi enzim COX-2 pada sel T47D perbesaran 10x40
Universitas Sumatera Utara
dkk., 2006. Pada perlakuan fraksi air EEKBPT dengan konsentrasi IC
50
b, jumlah sel yang mengekspresikan enzim COX-2 berkurang secara signifikan.
Jumlah sel yang mengekspresikan enzim COX-2 kembali meningkat ketika konsentrasi sampel uji diturunkan menjadi ½ IC
50
c, tetapi jika dibandingkan dengan kontrol sel konsentrasi sampel uji ½ IC
50
Berdasarkan pemaparan di atas hasil penelitian ini mendukung penelitian sebelumnya terkait dengan aktivitas EEKBPT dalam menghambatenzim COX-2
Amir, et al., 2013. Enzim COX-2 adalah enzim yang menginduksi inflamasi dan biosintesis prostaglandin Leahy, et al., 2000 dan terekspresi tinggi dalam sel
tumor Abukhalaf, 2004. Enzim COX-2 berperan penting dalam pembentukan prostaglandin sebagai pemicu ekspresi VEGF Vascular Endothelial Growth
Factor. Penekanan ekspresi VEGF akan menghambat angiogenesis yaitu proses pembentukan pembuluh darah baru yang berperan dalam dalam perpindahan sel
metastasis dan memastikan sel kanker prematur dapat bertahan hidup,sehingga penghambatan angiogenesis menyebabkan sel kanker mati karena tidak
mendapatkan asupan nutrisi dan oksigen dari darah dan tidak dapat bermetastasis ke bagian tubuh lain Fosslien, 2001.Penekanan ekspresi COX-2 akan
menurunkan produksi prostagandin PGE sehingga menghambat ekspresi Bcl-2, suatu gen antiapoptosis Shacter and Weitzman, 2002
. Dengan demikian diduga,
salah satu mekanisme antikanker fraksi air EEKBPT adalah penghambatan COX- 2 yang bertanggungjawab terhadap semua efek tersebut. Kemungkinan kandungan
masih tetap menunjukkan penghambatan ekspresi enzim COX-2. Ini menunjukkan bahwa fraksi air
EEKBPT mampu menekan ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D bergantung konsentrasi.
Universitas Sumatera Utara
flavonoid dan saponin pada fraksi air berperan dalam penghambatan enzim ini.Menurut Yamamoto, et al., 2001 flavonoid seperti kuersetin, resveratrol dan
mirisetin mampu memperantarai efek penghambatan COX-2 melalui downregulation jalur
nuclear Factor κ-B NF-κ-B. Belum ada mekanisme yang jelas yang mengemukakan aktivitas penghambatan COX-2 oleh flavonoid. Selain
flavonoid. saponin juga diduga memiliki aktivitas menghambat ekspresi COX-2. Hal ini kemungkinan disebabkan karena saponin terdiri dari steroid dan triterpen
aglikon yang mempunyai aksi seperti detergen, sehingga dapat berinteraksi dengan membran lipid Nutrional Therapeutics, 2003. Membran sel yang
tersusun dari lapisan fosfolipid merupakan prekursor dari COX-2 dan prostaglandin Hidayati, dkk., 2008. Oleh karena itu ketika saponin mampu
menganggu permeabilitas membran sel secara otomatis COX-2 tidak dapat terbentuk.
Berdasarkan pengamatan menggunakan doksorubisin sebagai kontrol positif d dan e, menunjukkan doksorubisin lebih kuat menekan ekspresi COX-
2 disebabkan jumlah sel yang berwarna ungu lebih banyak dibandingkan pada pemberian fraksi air EEKBPT. Pemberian doksorubisin dengan konsentrasi IC
50
sel kanker hampir mengalami lisis,ini kemungkinan disebabkan
konsentrasiIC
50
doksorubisin sangat toksik pada sel T47D, namun masih dapat diamati efek penekanannya terhadap ekspresi COX-2 karena hampir seluruh sel
memberi hasil negatif terhadap ekspresi COX-2. Seperti halnya dengan pemberian fraksi air EEKBPT jumlah sel yang mengekspresikan enzim COX-2 meningkat
saat konsentrasi doksorubisin diturunkan menjadi ½ IC
50
artinya efek penekanan
Universitas Sumatera Utara
ekspresi COX-2 dengan pemberian doksorubisin juga bergantung pada konsentrasi
.
Universitas Sumatera Utara
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
