dengan tekanan rendah pada suhu tidak lebih dari 50
o
3.8 Pembuatan Fraksi-Fraksi EEKBPT
C menggunakan rotary
evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental Depkes, 1995.
Sebanyak 20 g ektrak etanol dilarutkan dalam etanol 96 sampai larut kemudian ditambahkan 40 ml air suling, dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu
ditambahkan 100 ml n-heksana, lalu dikocok, dan didiamkan sampai terdapat 2 lapisan yang terpisah ± 30 menit. Lapisan n-heksana lapisan atas diambil
dengan cara dialirkan, dan fraksinasi dilakukan sampai lapisan n-heksana memberikan hasil negatif dengan pereaksi LB. Lapisan n-heksana yang
dikumpulkan dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh fraksi n-heksana. Kemudian pada residu sisaditambahkan 100 ml etilasetat, lalu
dikocok, didiamkan sampai terdapat 2 lapisan yang terpisah ± 30 menit, lapisan etilasetat lapisan atas diambil dengan cara dialirkan, dan fraksinasi dilakukan
sampai lapisan etilasetat memberikan hasil negatif dengan pereaksi FeCl
3
3.9 Uji Antikanker Ekstrak dan Fraksi EEKBPT
. Lapisan etilasetat yang dikumpulkan dipekatkan dengan rotary evaporator
sehingga diperoleh fraksi etilasetat. Lapisan air sisa diambil dan dipekatkan
dengan rotary evaporator sehingga didapat fraksi air Bassett, et al., 1994.
Pengujian antikanker fraksi EEKBT terhadap sel kanker payudara T47D dilakukan di Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta. Pengujian tersebut meliputi pembuatan media RPMI, pembuatan media kultur lengkap, penumbuhan sel T47D dan Vero, pembuatan
larutan uji, uji sitotoksik dan selectivity index ekstrak etanol, fraksi n-heksana, etilasetat dan air, pengujian penentuan fase penghambatan sel pada siklus sel
Universitas Sumatera Utara
dengan flowsitometer, sertaefek penekanan ekspresi enzim Cyclooxygenase-2
COX-2terhadap sel T47D dari fraksi yang paling aktif. 3.9.1 Pembuatan media RPMI
Komposisi: RPMI sachet
Hepes 2 gram
NaHCO
3
Aquabides ad 1 liter
2 gram
Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 g Hepes, dan 2 g NaHCO
3
dimasukkan kedalam erlenmeyer, lalu ditambahkan 800 ml aquabidest steril,
dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer. Kemudian pH diukur dengan pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4. Karena terlalu basa
maka digunakan HCl 1N untuk menyesuaikan pH.Kemudianditambahkan aquabides steril sampai 1 L, laludisterilisasi menggunakan filter vakum
didalam LAF Laminar air Flow.Filter aparatus steril dipasang pada botol duran 1 L steril.Proses penyaringan dilakukan menggunakan filter. Aliquot
media ditampung dalam botol duran 500 ml, lalu diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat,
kemudian disimpan pada suhu 2-8
o
3.9.2 Pembuatan media kultur lengkap MK-RPMI C CCRC, 2009.
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Penisilin-Streptomisin 2
Fungizone Amphotericin B 0,5
RPMI ad 100 ml
Cara Pembuatan:
Universitas Sumatera Utara
Semua bahan diatas dicampur, dan dilakukan didalam LAF, lalu pada botol MK-RPMI diberi identitas nama media, tanggal pembuatan, expire date,
dan nama pembuat, kemudian disimpan pada suhu 2-8
o
3.9.3 Pembuatan media M199 C CCRC, 2009.
Komposisi: M199 sachet
NaHCO
3
Hepes 2 gram
2,2 gram
Aquabides ad 1 liter
Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet M199, 2 g Hepes, dan 2 g NaHCO
3
dimasukkan kedalam erlenmeyer, lalu ditambahkan 800 ml aquabides steril, dihomogenkan
dengan menggunakan magnetic stirrer. Kemudian pH diukur dengan pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4. Karena terlalu basa maka digunakan HCl
1N untuk menyesuaikan pH.Kemudianditambahkan aquabides steril sampai 1 L, laludisterilisasi menggunakan filter vakum didalam LAF Laminar air
Flow.Filter aparatus steril dipasang pada botol duran 1 L steril.Proses penyaringan dilakukan menggunakan filter. Aliquot media ditampung dalam botol
duran 500 ml, lalu diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, kemudian disimpan pada suhu 2-8
o
3.9.4 Pembuatan media kultur lengkap M199 MK-M199
C CCRC, 2009.
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Penisilin-Streptomisin 2
Fungizone Amphotericin B 0,5
M199 ad 100 ml
Universitas Sumatera Utara
Cara Pembuatan:
Semua bahan diatas dicampur, dan dilakukan didalam LAF, lalu pada botol MK-M199 diberi identitas nama media, tanggal pembuatan, expire date,
dan nama pembuat, kemudian disimpan pada suhu 2-8
o
3.9.5 Penumbuhan sel T47D C CCRC, 2009.
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan. Seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF.Aliquot 10 ml media RPMI dimasukkan ke
dalam tabung konikel 15 ml, kemudian ampul yang berisi sel biakan diambil dari freezer -80
o
C dan dicairkan pada suhu kamar.Suspensi sel dalam ampul diambil, lalu dimasukkan tetes demi tetes kedalam media, lalu disentrifuge pada 600 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 4 ml MK-RPMI,kemudian diresuspensi hingga homogen. Suspensi sel ditransfer masing-masing 2 ml ke
dalam flask kultur baru. Sebanyak 5 ml MK-RPMIditambahkan ke dalam masing- masing flask, laludihomogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan
mikroskop inverted.Sel dipastikan tersebar pada seluruh permukaan flask tidak bergerombol pada bagian tertentu. Pada flask kultur diberi identitas, dan
kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
3.9.6 Penumbuhan sel Vero 5 CCRC, 2009.
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan.Seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF. Aliquot 10 ml media M199dimasukkan ke
dalam tabung konikel 15 ml, kemudian ampul yang berisi sel biakan diambil dari freezer -80
o
C dan dicairkan pada suhu kamar.Suspensi sel dalam ampul diambil, lalu dimasukkan tetes demi tetes kedalam media, lalu disentrifuge pada 600 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 4 ml MK-M199,kemudian
Universitas Sumatera Utara
diresuspensi hingga homogen. Suspensi sel ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Sebanyak 5 ml MK-M199ditambahkan ke dalam masing-
masing flask, laludihomogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan mikroskop inverted.Sel dipastikan tersebar pada seluruh permukaan flask tidak
bergerombol pada bagian tertentu. Pada flask kultur diberi identitas, dan kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
3.9.7 Subkultur sel 5 CCRC, 2009.
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan, seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF. Proses panen sel dilakukan dengan cara
mengambil 500 µl panenan sel dan dimasukkan ke dalam flask kultur. Kemudian ditambahkan 6 ml media kultur masing-masing sel, dan dihomogenkan. Sel
diinkubasi pada inkubator CO
2
3.9.8 Panen sel
5, kondisi sel diamati pada keesokan harinya
CCRC, 2009.
Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluensel sudah menempel dan berkembang memenuhi flaskkultur, semua pekerjaan dilakukan di
dalam LAF. Media kultur dibuang dari flask dengan mikropipet, kemudian sel dicuci 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer Saline, ditambahkan 400 µl
Tripsin-EDTA 0,25 secara merata untuk melepas sel yang melekat pada dinding flask, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
5 selama ± 5 menit, dan ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Sel diresuspensi dengan
mikropipet agar bergerombol. Keadaan sel diamati di mikroskop inverted. Sel diresuspensi jika masih ada yang bergerombol. Kemudian sel ditransfer ke dalam
tabung konikel CCRC, 2009.
Universitas Sumatera Utara
3.9.9 Penghitungan sel
Sepuluh 10 µl panenan sel diambil dan dipipet ke dalam hemositometer kamar hitung. Jumlah sel dihitung dibawah mikroskop inverteddengan
perbesaran 10x10 menggunakan alat hitung Gambar 3.1.
Gambar 3.1 Hemositometer kamar hitung
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B,C, dan D, setiap kamar terdiri dari 16 kotak.Sel pada 4 kamar dihitung, sel yang berwarna gelap dan yang
berada dibatas luar, di sebelah kiri dan di atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas
kanan dan bawah ikut dihitung.Jumlah sel per ml dihitungmenggunakan rumus :
∑selmL = ∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑ sel D
4 × 10
4
Setelah jumlah per ml didapat kemudian dihitung volume panenan sel yang diperlukan, dimana untuk menanam sel pada 96-well plate jumlah total sel
yang diperlukan adalah 1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1x 10
volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dihitung dengan rumus:
������ ������� ��� = Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitungml
6
Panenan sel dimbil, ditransfer ke tabung konikel, kemudian ditambahkan
media kultur yang sesuai sampai total volume yang diperlukan CCRC, 2009.
Universitas Sumatera Utara
3.9.10 Pembuatan larutan uji
Masing-masing sampel ditimbang sebanyak 50 mg dalam polytube, kemudian dilarutkan dalam50 µl dimetilsulfoksida DMSO, divortex agar sampel
larut sempurna lalu dicukupkan dengan media kultur, kemudian dibuat pengenceran sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 250 µgml, 125
µgml, 62,5 µgml, 31,25 µgml dan 15,125 µgml. Semua pengenceran dilakukan
menggunakan media kultur yang sesuai CCRC, 2009. 3.10 Uji Sitotoksik Ekstrak dan Fraksi EEKBPTMenggunakan Metode MTT
Uji sitotoksik pada penelitianmenggunakan metode MTT. Metode MTT [3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu uji
sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna kolorimetri yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel
hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan direduksi menjadi
formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium, yang termasuk dalam
mitokondria dari sel hidup Kupcsick, 2011.
Sel T47D ditanam pada 96-well platesehingga diperoleh kepadatan 10.000 selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang
baik. Setelah 24 jam media kultur diganti dengan media yang baru, kemudian ditambahkan larutan uji dengan berbagai konsentrasi dan diinkubasi pada suhu
37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang, kemudian sel dicuci dengan PBS. Pada masing-masing
sumuran, ditambahkan 100μL media kultur dan 10μL MTT5 mgmL. Untuk mengamati viabilitasnya, sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator
Universitas Sumatera Utara
CO
2
5 pada suhu 37
o
3.11 Analisis Hasil
Kategori