Propagasi dan panen sel mieloma Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

E. Propagasi dan panen sel mieloma

Untuk menghindari perubahan genetik, sel mieloma perlu dibekukan dalam tangki nitrogen cair sehingga kondisi sel mieloma tetap normal. Kemudian suspensi sel mieloma perlu disentrifugasi sehingga pelet sel terpisah dari medium dan mengendap di dasar tabung conical. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 3000 rpm, sebagai kecepatan optimum untuk menghasilkan pelet sel mieloma yang padat, tidak rusak dan mudah diresuspensikan. Setelah berumur 7 hari, populasi kultur sel mieloma telah menempati seluruh permukaan area tumbuh dan jumlahnya telah mencukupi untuk penelitian. Oleh karena itu, kultur sel mieloma siap dipanen dan digunakan untuk penelitian. Sel yang siap panen merupakan sel yang fase pertumbuhannya menurunberhenti karena kehabisan nutrisi sehingga dilakukan penggantian medium kultur. Kultur sel mieloma yang melekat pada flask dilepaskan dengan resuspensi secara perlahan dan dipindahkan ke dalam tabung conical untuk disentrifugasi. Tujuannya adalah untuk memisahkan pelet sel mieloma dan mediumnya sehingga dapat dihitung jumlah sel total dengan menggunakan haemocytometer. Setelah dipanen, dilakukan pengamatan morfologi sel mieloma. Kultur sel mieloma hidup berbentuk hampir bulat sempurna, bening cemerlang, tidak keruh pada bagian inti, dan berada pada dasar flask. Kultur sel mieloma mati terlihat mengapung pada media, keruh pada bagian intinya Doyle and Griffiths, 2000. Morfologi kultur sel mieloma tampak pada gambar berikut: Gambar 1. Foto kultur sel mieloma di sumuran kontrol perbesaran 100x Ket. : semua kultur sel mieloma hidup

F. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

Dalam penelitian ini, uji sitotoksitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. Pengujian dilakukan dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan blue untuk mengamati morfologi dan menetapkan persen kematian kultur sel mieloma. Dari hasil uji sitotoksisitas dapat ditentukan harga LC 50 , yaitu konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu mematikan 50 populasi kultur sel mieloma. Prinsip metode perhitungan langsung adalah pengamatan dan perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang mati dan hidup dengan menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini, trypan blue digunakan untuk membantu pengamatan dan perhitungan jumlah kultur sel mieloma. Kultur sel mieloma mati akan kehilangan integritas membrannya, sehingga trypan blue dapat masuk ke dalam dan mewarnai inti sel, sedangkan pada kultur sel mieloma hidup, trypan blue tidak dapat masuk dan mewarnai inti sel karena adanya selektifitas membran selnya. Pada kultur sel mieloma yang mati, sel akan tampak berwarna biru, bentuknya lebih besar dan membengkak. Sedangkan pada kultur sel mieloma yang hidup, sel akan tampak bersinar, bentuknya kecil gambar 2. Gambar 2. Kultur sel mieloma di haemocytometer perbesaran 100x Ket. : i = sel mieloma hidup dan ii = sel mieloma mati Dalam metode ini, dilakukan perhitungan jumlah sel mieloma hidup dan direpresentasikan dalam bentuk persen kematian sel. Persentase kematian kultur sel mieloma merupakan persentase hasil pengurangan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok kontrol dengan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok perlakuan dibagi dengan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok kontrol. Hasil persentase kematian kultur sel mieloma menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi maka persen kematian kultur sel semakin meningkat gambar 3. Hal ini terlihat pada konsentrasi 2000 dan 1750 µgml, persentase kematian kultur sel mieloma sebesar 100 . Persentase kematian 50 diprediksikan berada disekitar konsentrasi 500 µgml yang menghasilkan persentase kematian sebesar 50,69; 49,32; dan 49,32 . tabel II. i ii Tabel II. Data persentase kematian kultur sel mieloma Konsentrasi µgml pada penetapan I II III 2000 100,00 100,00 100,00 1750 100,00 100,00 100,00 1500 95,89 94,52 94,52 1250 84,93 84,93 84,93 1000 75,34 73,97 73,97 750 63,01 63,01 63,01 500 50,69 49,32 49,32 250 36,99 36,99 36,99 Gambar 3. Grafik konsentrasi µgml terhadap kematian kultur sel mieloma Kematian kultur sel mieloma juga dapat diketahui dengan pengamatan morfologi sel pada setiap konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Pada konsentrasi 250, 500 dan 750 µgml, sel yang hidup dan mati terlihat secara jelas. Kultur sel mieloma hidup berbentuk hampir bulat sempurna dan bercahaya. Sedangkan pada kultur sel mieloma yang mati, bentuk sel berubah dan sel terlihat keruh. Perbedaan yang signifikan ini dapat dilihat pada kadar 1750 dan 2000 µgml, sel mieloma mengalami kematian gambar 4. ii ii i i konsentrasi 250 µgml konsentrasi 500 µgml konsentrasi 750 µgml konsentrasi 1000 µgml konsentrasi 1250 µgml konsentrasi 1500 µgml ii i i ii i ii ii i ii ii konsentrasi 1750 µgml konsentrasi 2000 µgml Gambar 4. Kultur sel mieloma di sumuran perlakuan perbesaran 100x Ket. : i = sel mieloma hidup dan ii = sel mieloma mati Kekurangan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan blue adalah perhitungan sel membutuhkan waktu yang lama dan subjektifitasnya tinggi. Untuk mengatasi hal ini, maka perhitungan sel dilakukan minimal 3 kali oleh orang yang sama untuk mengurangi tingkat kesalahan. Selain itu, setelah pemaparan trypan blue, kultur sel mieloma harus segera dihitung karena dapat menyebabkan toksisitas pada sel hidup sehingga mengurangi keakuratan perhitungan. Kelebihan metode ini adalah mudah dilakukansederhana, ekonomis, dan dapat mengamati sel yang hidup dan mati secara langsung. Untuk mengetahui efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma, maka dalam penelitian ini digunakan kontrol kultur sel mieloma. Hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan metode Anova satu arah untuk mengetahui apakah jumlah kematian sel pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan berbeda secara signifikan atau tidak. Analisis statistik Anova satu arah dapat dilakukan apabila data yang dikaji memiliki distribusi normal, sampel bersifat independentidak terikat sampel yang lain dan memiliki nilai varian yang sama Harinaldi, 2005. Oleh karena itu, dilakukan uji Kolmogorov-Smirnov. Hasil pengolahan data dengan SPSS menunjukkan bahwa data yang dikaji memiliki distribusi yang normal α 0,05 dan nilai varian yang sama sehingga data dapat dianalisis dengan Anova satu arah. Hasil analisis menunjukkan jumlah kematian sel pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan berbeda secara signifikan, artinya ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma. Untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah, dilakukan analisis probit. Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk mengetahui hubungan konsentrasi-respon persentase kematian sel agar diperoleh persamaan garis lurus yang dapat digunakan untuk menentukan LC 50 dengan lebih akurat Nurrochmad, 2001. Analisis probit merupakan analisis regresi antara log konsentrasi dengan harga probit. Harga probit didapatkan dari tabel probit lampiran 8 yang disesuaikan dengan persentase kematian kultur sel mieloma. Dalam analisis probit, perlu dilakukan uji linearitas pada setiap penetapan. Hasil uji linearitas menunjukkan bahwa r hitung r [4, 0,05] lampiran 6, artinya grafik pada penetapan I, II, dan III bersifat linear gambar 5, 6 dan 7. Grafik yang linear menggambarkan bahwa log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah berbanding lurus dengan harga probit, sehingga LC 50 dapat dihitung secara akurat. Dari hasil analisis probit didapatkan harga LC 50 rata-rata sebesar 434,1 µgml. Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan I Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan II Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan III Semakin kecil LC 50 suatu senyawa maka semakin toksik senyawa tersebut Doyle and Griffiths, 2000. Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki LC 50 20 µgml terhadap kultur sel mieloma. Penelitian sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah juga dilakukan terhadap kultur sel kanker yang lain dengan nilai LC 50 sebesar 1.143,1 µgml pada sel HeLa Atmaningsih, 2008, nilai LC 50 sebesar 587,7 µgml pada sel T47D Neritika, 2008, nilai LC 50 sebesar 200,7 µgml pada sel SiHa Nur’aniyah, 2008, dan nilai LC 50 sebesar 395,5 µgml pada sel Raji Kusumaningtyas, 2008. Perbedaan harga LC 50 pada sel HeLa, SiHa, T47D, raji dan mieloma disebabkan oleh perbedaan karakteristik sel yang berpengaruh terhadap sitotoksisitas pada sel tersebut. Berdasarkan kriteria National Cancer Institute NCI, suatu senyawa yang dapat dikembangkan sebagai antikanker adalah senyawa dengan LC 50 ≤ 20 µgml Swanson and Pezzuto, Devie, 2007. Dalam penelitian ini, digunakan ekstrak etanolik daun sirih merah mengandung banyak senyawa yang kemungkinan berpotensi sebagai antikanker. Oleh karena itu, daun sirih merah dapat dikembangkan sebagai antikanker apabila ditemukan senyawa tunggal yang bertanggung jawab atas aktivitas antikanker tersebut dan memiliki LC 50 ≤ 20 µgml.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN