4. Pembuatan larutan uji
Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak
induk dengan konsentrasi 100 mgml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µgml, 500 µgml, 750 µgml, 1000
µgml, 1250 µgml, 1500 µgml, 1750 µgml, dan 2000 µgml. 5. Pembuatan medium pencuci
RPMI-1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu
disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara aseptis.
Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4
o
C Freshney, 1986; Jacoby
and Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989. 6. Pembuatan medium penumbuh
Untuk medium RPMI-1640 serum, ditambahkan FBS Foetal Bovine Serum 10, penisilin-streptomisin 1 dan fungison 0,5 dalam medium RPMI-
1640 dan disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara
aseptis. Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4
o
C Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
7. Propagasi sel mieloma
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70. Ampul dibuka
dan sel mieloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI- 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan
medium RPMI-1640 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan
dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam
tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby and
Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
8. Panen sel mieloma
Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, medium diganti dengan RPMI-1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding
flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI-1640 sampai volum 10
ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian
dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2x10
4
100 μl dan siap dipakai untuk
penelitian Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
Suspensi kultur sel mieloma dengan kepadatan 2 x 10
4
sel 100 μl medium
diambil sebanyak 100 μl dan dimasukkan ke dalam sumuran 96-well plate bersama
dengan ekstrak uji sesuai seri konsentrasi yang dibuat, yaitu 250 µgml, 500 µgml, 750 µgml, 1000
μgml, 1250 μgml, 1500 μgml, 1750 μgml, dan 2000 μgml. Untuk kontrol, digunakan 100
μl suspensi sel dan ditambahkan medium. Setelah itu, plate diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37
C dan aliran 5 CO
2
selama 24 jam. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, kemudian
ditambahkan 50 μl trypan blue. Tiap sumuran diambil 10 μl dan masukkan dalam
haemocytometer. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel hidup pada control dan tiap konsentrasi di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat
transparan. Sedangkan sel yang mati akan tampak gelap dan tidak cemerlang.
E. Analisis Hasil
Kategori