3. Dosis rokok Penentuan jumlah rokok yang digunakan dalam penelitian ini
mengacu pada penelitian Adyttia et al. 2014. Pada penelitian tersebut menunjukkan bahwa pemberian rokok 3 batanghari selama 14 hari pada
tikus mampu meningkatkan kadar MDA tikus. Oleh sebab itu, pada penelitian ini jumlah rokok yang digunakan adalah 3 batanghari selama 14
hari.
E. Alat dan Bahan Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam Tabel 5 dan 6.
Tabel 5. Alat penelitian
No Nama Alat
Fungsi
1. Gelas ukur
Tempat untuk mengukur aquades dan larutan ekstrak kulit buah rambutan
2. Pengaduk
Untuk mengaduk ekstrak kulit buah rambutan
3. Neraca digital
Untuk menimbang berat tikus 4.
Wadah minum Tempat minum tikus
5. Sonde lambung spuit
Alat untuk menginjeksi ekstrak kulit buah rambutan secara oral
6. Kandang tikus
Tempat pemeliharaan tikus dengan ukuran 36 cm x 28 cm x 12 cm
7. Smoking chamber
Tempat untuk pengasapan rokok pada tikus dengan ukuran 42 cm x 29 cm x 33
cm
8. Pipet hematokrit
Untuk mengambil darah pada sinus orbitalis tikus
9. Tabung eppendorf
Untuk menampung darah 10.
Sentrifuge scientific Untuk memisahkan bagian-bagian pada sel
darah 11.
Container box Untuk penyimpanan sementara sampel
darah saat dibawa ke laboratorium 12.
Kamera Sebagai dokumentasi
Tabel 6. Bahan penelitian
No Nama Bahan
Fungsi
1. Ekstrak kulit buah
rambutan Bahan uji coba yang dilakukan
2. Asap rokok kretek
Bahan uji coba sebagai radikal bebas 3.
Akuades Pelarut ekstrak kulit buah rambutan
4. EDTA
Untuk mencegah terjadinya koagulasi atau penggumpalan darah
5. Tikus putih jantan
Hewan uji coba 6.
Asam pikrat Untuk menandai tikus
7. 8.
Kapastissue Etanol
Untuk membersihkan alat Pelarut ekstraksi kulit buah rambutan
Gambar 8. Alur penelitian 30 ekor tikus
E Asap rokok
+ ekstrak kulit buah
rambutan 6 mg200gB
B D
Asap rokok + ekstrak
kulit buah rambutan 3
mg200gBB C
Asap rokok + Vitamin C
1 mg200gBB
B Asap
rokokhar i
A akuades
F Asap rokok
+ ekstrak kulit buah
rambutan 12
mg200gBB Aklimatisasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar dan akuades
Perlakuan dilakukan selama 14 hari
Mengambil sampel darah pada hari ke 15
Mengukur kadar MDA dan SOD
Analisis data Randomisasi menjadi 6 kelompok
F. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah yang telah dipotong menjadi bagian kecil. Kulit buah kemudian
dicuci menggunakan air mengalir dan dikeringkan di dalam ruangan selama 3-5 hari. Kulit yang sudah kering selanjutnya dihaluskan menggunakan
blender hingga didapat serbuk kering. Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode maserasi. Serbuk kering diekstrasi
menggunakan pelarut etanol 96 selama 24 jam pada suhu kamar dengan perbandingan 1:1. Suspensi yang diperoleh disaring menggunakan kertas
Whatman No. 1. Filtrat yang terkumpul diuapkan menggunakan rotary evaporator hingga terbentuk pasta.
2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Menggunakan DPPH
Pengukuran diawali dengan pembuatan larutan DPPH. Sebanyak 1,97 mg DPPH dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai 100 ml,
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,05 mM. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah rambutan.
Sebanyak 25 mg ekstrak kulit buah rambutan dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai 25 ml. Kemudian pada labu ukur sampel
ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM. Larutan blanko dibuat dengan cara larutan DPPH 0,5 mM dipipet sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 25 ml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Absorbansi DPPH diukur menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur sebagai penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya penambahan sampel.
Nilai serapan larutan DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut :
3. Perlakuan Hewan Percobaan
Penelitian ini diawali dengan mempersiapkan 30 ekor tikus putih galur Wistar yang diaklimatisasi selama 7 hari. Hewan percobaan
dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok masing-masing kelompok 5 ekor. Hewan ditempatkan pada kandang individual yang dibersihkan
setiap hari. Tikus diberi pakan standar dan air minum secara ad libitum selama penelitian. Proses pemaparan dilakukan setiap pagi menggunakan 3
batang rokok dalam satu hari. Pemaparan dilakukan selama 14 hari. Pada saat akan diberi paparan asap rokok, hewan coba dipindahkan ke dalam
kandang khusus yaitu smoking chamber sesuai kelompoknya. Kandang tersebut merupakan kotak pengasapan yang di dalamnya terdapat jeruji
pembatas untuk memisahkan hewan coba dengan ujung rokok yang terbakar. Apabila hewan coba dimasukkan maka tikus dapat secara langsung
terkena paparan asap rokok. Asap rokok dihembuskan berulang kali dengan bantuan tabung injeksi hingga rokok habis terbakar. Pemberian ekstrak kulit
buah rambutan dilakukan satu jam setelah paparan asap rokok.
4. Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan pada hari ke 15 penelitian. Darah diambil dari sinus orbitalis dengan hematokrit sebanyak 3 ml dan
ditampung dalam tabung eppendorf yang telah berisi EDTA. Sampel yang digunakan untuk pengukuran kadar MDA adalah plasma darah dan untuk
pengukuran aktivitas SOD adalah whole blood. Darah yang terkumpul selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4 C. Plasma yang terbentuk dipindah ke dalam tabung baru dan
disimpan pada suhu -80 C sampai siap untuk dianalisis. Larutan penyangga
yang terbentuk dihilangkan dari pelet eritrosit, kemudian eritrosit dilarutkan sebanyak 5X volumenya dengan menggunakan ddH
2
O. Eritrosit yang telah dilarutkan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm dan
supernatan yang terbentuk disimpan pada suhu -80 C sampai siap untuk
dianalisis.
5. Pengukuran Kadar MDA
Pemeriksaan kadar MDA menggunakan plasma darah. Prosedur pengukuran kadar MDA dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Prosedur pengukuran kadar MDA Sampel
Blanko Sampel plasma
200 µl -
TCA 15 2000 µl
2000 µl TBA 0,37 dalam HCl 0,25 N
2000 µl 2000 µl
Campuran tersebut selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 95
C selama 60 menit. Kemudian tabung diletakkan pada ice bath selama 15 menit. Sampel yang sudah dingin disentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam kuvet kemudian dibaca absorbansinya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 545 nm. Rumus penghitungan kadar MDA nmolml :
6. Pengukuran Aktivitas SOD
Pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan menggunakan metode kalorimetri. Sampel yang digunakan dalam pengukuran ini adalah whole
blood. Prosedur pengukuran aktivitas SOD dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD
Sampel Blanko 1
Blanko 2 Blanko 3 Whole blood
20 µl -
20 µl -
ddH
2
O -
20 µl -
20 µl Larutan pereaksi WST
200 µl 200 µl
200 µl 200 µl
Larutan pengencer buffer -
- 20 µl
20 µl Larutan pereaksi enzim
20 µl 20 µl
- -
Semua larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 20 menit,
selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 450 nm menggunakan microplate reader
Rumus penghitungan aktivitas SOD :
G. Analisis Data