Alat dan Bahan Penelitian Prosedur Penelitian

3. Dosis rokok Penentuan jumlah rokok yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Adyttia et al. 2014. Pada penelitian tersebut menunjukkan bahwa pemberian rokok 3 batanghari selama 14 hari pada tikus mampu meningkatkan kadar MDA tikus. Oleh sebab itu, pada penelitian ini jumlah rokok yang digunakan adalah 3 batanghari selama 14 hari.

E. Alat dan Bahan Penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam Tabel 5 dan 6. Tabel 5. Alat penelitian No Nama Alat Fungsi 1. Gelas ukur Tempat untuk mengukur aquades dan larutan ekstrak kulit buah rambutan 2. Pengaduk Untuk mengaduk ekstrak kulit buah rambutan 3. Neraca digital Untuk menimbang berat tikus 4. Wadah minum Tempat minum tikus 5. Sonde lambung spuit Alat untuk menginjeksi ekstrak kulit buah rambutan secara oral 6. Kandang tikus Tempat pemeliharaan tikus dengan ukuran 36 cm x 28 cm x 12 cm 7. Smoking chamber Tempat untuk pengasapan rokok pada tikus dengan ukuran 42 cm x 29 cm x 33 cm 8. Pipet hematokrit Untuk mengambil darah pada sinus orbitalis tikus 9. Tabung eppendorf Untuk menampung darah 10. Sentrifuge scientific Untuk memisahkan bagian-bagian pada sel darah 11. Container box Untuk penyimpanan sementara sampel darah saat dibawa ke laboratorium 12. Kamera Sebagai dokumentasi Tabel 6. Bahan penelitian No Nama Bahan Fungsi 1. Ekstrak kulit buah rambutan Bahan uji coba yang dilakukan 2. Asap rokok kretek Bahan uji coba sebagai radikal bebas 3. Akuades Pelarut ekstrak kulit buah rambutan 4. EDTA Untuk mencegah terjadinya koagulasi atau penggumpalan darah 5. Tikus putih jantan Hewan uji coba 6. Asam pikrat Untuk menandai tikus 7. 8. Kapastissue Etanol Untuk membersihkan alat Pelarut ekstraksi kulit buah rambutan Gambar 8. Alur penelitian 30 ekor tikus E Asap rokok + ekstrak kulit buah rambutan 6 mg200gB B D Asap rokok + ekstrak kulit buah rambutan 3 mg200gBB C Asap rokok + Vitamin C 1 mg200gBB B Asap rokokhar i A akuades F Asap rokok + ekstrak kulit buah rambutan 12 mg200gBB Aklimatisasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar dan akuades Perlakuan dilakukan selama 14 hari Mengambil sampel darah pada hari ke 15 Mengukur kadar MDA dan SOD Analisis data Randomisasi menjadi 6 kelompok

F. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Rambutan

Kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah yang telah dipotong menjadi bagian kecil. Kulit buah kemudian dicuci menggunakan air mengalir dan dikeringkan di dalam ruangan selama 3-5 hari. Kulit yang sudah kering selanjutnya dihaluskan menggunakan blender hingga didapat serbuk kering. Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode maserasi. Serbuk kering diekstrasi menggunakan pelarut etanol 96 selama 24 jam pada suhu kamar dengan perbandingan 1:1. Suspensi yang diperoleh disaring menggunakan kertas Whatman No. 1. Filtrat yang terkumpul diuapkan menggunakan rotary evaporator hingga terbentuk pasta.

2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Menggunakan DPPH

Pengukuran diawali dengan pembuatan larutan DPPH. Sebanyak 1,97 mg DPPH dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai 100 ml, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,05 mM. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah rambutan. Sebanyak 25 mg ekstrak kulit buah rambutan dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai 25 ml. Kemudian pada labu ukur sampel ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM. Larutan blanko dibuat dengan cara larutan DPPH 0,5 mM dipipet sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Absorbansi DPPH diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur sebagai penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya penambahan sampel. Nilai serapan larutan DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut :

3. Perlakuan Hewan Percobaan

Penelitian ini diawali dengan mempersiapkan 30 ekor tikus putih galur Wistar yang diaklimatisasi selama 7 hari. Hewan percobaan dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok masing-masing kelompok 5 ekor. Hewan ditempatkan pada kandang individual yang dibersihkan setiap hari. Tikus diberi pakan standar dan air minum secara ad libitum selama penelitian. Proses pemaparan dilakukan setiap pagi menggunakan 3 batang rokok dalam satu hari. Pemaparan dilakukan selama 14 hari. Pada saat akan diberi paparan asap rokok, hewan coba dipindahkan ke dalam kandang khusus yaitu smoking chamber sesuai kelompoknya. Kandang tersebut merupakan kotak pengasapan yang di dalamnya terdapat jeruji pembatas untuk memisahkan hewan coba dengan ujung rokok yang terbakar. Apabila hewan coba dimasukkan maka tikus dapat secara langsung terkena paparan asap rokok. Asap rokok dihembuskan berulang kali dengan bantuan tabung injeksi hingga rokok habis terbakar. Pemberian ekstrak kulit buah rambutan dilakukan satu jam setelah paparan asap rokok.

4. Pengambilan Darah

Pengambilan darah dilakukan pada hari ke 15 penelitian. Darah diambil dari sinus orbitalis dengan hematokrit sebanyak 3 ml dan ditampung dalam tabung eppendorf yang telah berisi EDTA. Sampel yang digunakan untuk pengukuran kadar MDA adalah plasma darah dan untuk pengukuran aktivitas SOD adalah whole blood. Darah yang terkumpul selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 C. Plasma yang terbentuk dipindah ke dalam tabung baru dan disimpan pada suhu -80 C sampai siap untuk dianalisis. Larutan penyangga yang terbentuk dihilangkan dari pelet eritrosit, kemudian eritrosit dilarutkan sebanyak 5X volumenya dengan menggunakan ddH 2 O. Eritrosit yang telah dilarutkan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm dan supernatan yang terbentuk disimpan pada suhu -80 C sampai siap untuk dianalisis.

5. Pengukuran Kadar MDA

Pemeriksaan kadar MDA menggunakan plasma darah. Prosedur pengukuran kadar MDA dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7. Prosedur pengukuran kadar MDA Sampel Blanko Sampel plasma 200 µl - TCA 15 2000 µl 2000 µl TBA 0,37 dalam HCl 0,25 N 2000 µl 2000 µl Campuran tersebut selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 95 C selama 60 menit. Kemudian tabung diletakkan pada ice bath selama 15 menit. Sampel yang sudah dingin disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam kuvet kemudian dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 545 nm. Rumus penghitungan kadar MDA nmolml :

6. Pengukuran Aktivitas SOD

Pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan menggunakan metode kalorimetri. Sampel yang digunakan dalam pengukuran ini adalah whole blood. Prosedur pengukuran aktivitas SOD dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD Sampel Blanko 1 Blanko 2 Blanko 3 Whole blood 20 µl - 20 µl - ddH 2 O - 20 µl - 20 µl Larutan pereaksi WST 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Larutan pengencer buffer - - 20 µl 20 µl Larutan pereaksi enzim 20 µl 20 µl - - Semua larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 20 menit, selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 450 nm menggunakan microplate reader Rumus penghitungan aktivitas SOD :

G. Analisis Data

Dokumen yang terkait

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera L.) SEBAGAI ANTIOKSIDAN TERHADAP PENURUNAN KADAR MDA PLASMA DARAH TIKUS PUTIH (Rattus novergicus strain wistar) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK SECARA AKUT

0 5 24

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SALAM (Syzygium polyanthum) SEBAGAI ANTIOKSIDAN TERHADAP KADAR MALONDIALDEHID (MDA) TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK

4 25 21

PENGARUH EKSTRAK DAUN SAMBILOTO (Andrographis paniculata Nees) TERHADAP PENURUNAN KADAR MDA(Malondialdehyde) PLASMA DARAH TIKUS PUTIH (Rattus novergicus strain wistar) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK SECARA SUBAKUT

2 48 23

Efek Ekstrak Sambiloto (Andrographis paniculata Ness.) terhadap Peningkatan Kadar Superoksida Dismutase (SOD) Plasma Darah Tikus Putih (Rattus norvegicus strain wistar) yang Dipapar Asap Rokok

1 21 17

PENGARUH EKSTRAK MENIRAN (Phyllanthus niruri L.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHID (MDA) PLASMA DARAH TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus strain wistar) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK

0 11 15

EFEK EKSTRAK MENIRAN (Phyllanthus niruri Linn.) TERHADAP PENINGKATAN KADAR SOD (Superoksida Dismutase) PLASMA DARAH TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus strain wistar) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK

1 18 23

Efek Ekstrak Pomegranate terhadap Kadar Malondialdehida (MDA) dan Gambaran Mikroskopik Hati Tikus strain Sprague dawley yang Dipaparkan Asap Rokok

0 3 43

EFEK EKSTRAK KULIT BUAH RAMBUTAN TERHADAP JUMLAH ERITROSIT, KADAR HEMOGLOBIN DAN HEMATOKRIT TIKUS PUTIH YANG DIPAPAR ASAP ROKOK

5 35 101

PENGARUH EKSTRAK KULIT BUAH RAMBUTAN (Nephelium lappaceum) TERHADAP KUALITAS SPERMA TIKUS YANG TERPAPAR ASAP ROKOK

0 5 35

Efek Pemberian Ekstrak Delima Merah terhadap Kadar SOD dan MDA pada Kultur HUVECs yang dipapar Plasma Preeklampsi

0 0 6