18
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel bebas : seri konsentrasi ekstrak etanol daun beluntas dan daun
kemangi 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50.
b. Variabel tergantung : diameter zona hambat pertumbuhan
Staphylococcus epidermidis mm.
c. Variabel pengacau terkendali : media penanaman bakteri Mueller
Hinton Agar , suhu inkubasi 37
o
C, lama inkubasi 18-24 jam, diameter sumuran 6 mm, kepadatan suspensi bakteri uji yang setara dengan
larutan standar 0,5 Mac Farland 1,5.10
8
CFUml, asal simplisia daun beluntas Merapi Farma Medika dan daun kemangi pasar Beringharjo,
pelarut ekstrak etanol 70.
d. Variabel pengacau tak terkendali : umur tanaman dan kondisi lingkungan
tempat tumbuh tanaman beluntas dan kemangi.
2. Definisi operasional
a. Maserasi adalah maserasi yang dilakukan secara mekanis dengan
pengadukan secara terus-menerus dengan orbital shaker selama ± 72
jam.
b. Ekstrak etanol daun beluntas adalah sediaan kental yang dibuat dengan
mengekstraksi secara maserasi serbuk daun beluntas dengan etanol 70
pada suhu ruangan.
c. Ekstrak etanol daun kemangi adalah sediaan kental yang dibuat dengan
mengekstraksi secara maserasi serbuk daun kemangi dengan etanol 70
pada suhu ruangan.
d. Daya antibakteri adalah kemampuan ekstrak etanol daun beluntas atau
daun kemangi untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh Staphylococcus epidermidis
yang ditunjukkan dengan adanya zona
hambat.
e. Zona hambat adalah daerah diameter area hambatan yang terlihat jernih
dari ekstrak etanol daun beluntas atau daun kemangi terhadap pertumbuhan Staphylococcus epidermidis yang terdapat di sekitar
sumuran.
f. Kontrol positif adalah antibiotika yang telah beredar di pasaran dengan
nama dagang Mediklin
®
Klindamisin fosfat 1,2.
g. KHM adalah kadar minimal ekstrak etanol daun beluntas dan daun
kemangi untuk menghambat pertumbuhan Staphylococcus epidermidis.
h. KBM adalah kadar minimal ekstrak etanol daun beluntas dan daun
kemangi untuk membunuh pertumbuhan Staphylococcus epidermidis.
C. Bahan Penelitian
Daun beluntas kering diperoleh dari Merapi Farma Herbal, daun kemangi segar diperoleh dari pasar Beringharjo, pelarut ekstrak etanol 70, kultur murni
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 diperoleh dari Balai Laboratorium
Kesehatan Yogyakarta, media MHA Mueller Hinton Agar, NaCl diperoleh dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta, aquadest, Mediklin
®
Klindamisin fosfat 1,2 sebagai kontrol positif, etanol 70 sebagai kontrol pelarut.
D. Alat Penelitian
Oven, vaccum rotary evaporator, vakum, autoklaf, inkubator, vortex, alat-alat gelas, ose, neraca analitik, mikropipet, pelubang sumuran, densicheck,
seperangkat alat maserasi, kompor listrik, blender, pengayak, penggaris satuan mm, lampu spiritus.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi daun beluntas dan daun kemangi
Determinasi dilakukan dengan menggunakan kunci determinasi dengan mengacu pada Buku Acuan Flora untuk Sekolah di Indonesia.
2. Pengumpulan, pengeringan dan pembuatan serbuk bahan
Dua kilogram daun beluntas kering diperoleh dari Merapi Farma Herbal.
Dua puluh lima kilogram kemangi segar diperoleh dari Pasar Beringharjo. Daun kemangi dipisah dengan batang dan bunganya untuk
selanjutnya dicuci dengan air bersih dan dikeringkan. Pengeringan daun kemangi dilakukan di dalam oven pada suhu
40-50
o
C selama ± 24 jam. Kedua daun yang sudah kering kemudian diserbuk dengan cara diblender dan diayak dengan ayakan tepung.
3. Pembuatan ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi dengan
metode maserasi
Tiga puluh gram serbuk kering simplisia daun beluntas ditambah dengan 160 ml etanol 70 kemudian dimaserasi. Tiga puluh gram serbuk
simplisia daun kemangi ditambah dengan 180 ml etanol 70 dan dimaserasi. Maserat daun beluntas disaring dengan bantuan vakum dan
dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga pelarutnya menguap sebanyak ± 35 ml Lampiran 6 gambar A. Maserat daun
kemangi juga disaring dan dipekatkan hingga pelarutnya menguap sebanyak ± 40 ml Lampiran 6 gambar B. Untuk mendapatkan ekstrak
kental, setelah dipekatkan maka ekstrak dioven pada suhu 50
o
C selama ± 24 jam.
4. Pembuatan seri konsentrasi
Dibuat konsentrasi 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 dari ekstrak kental daun beluntas dan daun kemangi. Pembuatan konsentrasi 50
dengan mengambil ekstrak daun kemangi atau ekstrak daun beluntas
sebanyak 5 gram kemudian dilarutkan dalam 10 ml etanol 70 kemudian diturunkan menjadi konsentrasi 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 dengan
melarutkan ke dalam etanol 70 hingga 10 ml.
5. Uji daya antibakteri ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi
terhadap
Staphylococcus epidermidis a.
Pembuatan suspensi bakteri uji
Pembuatan suspensi bakteri uji dilakukan dengan cara menanam kultur bakteri uji di dalam NaCl fisiologis kemudian
kekeruhannya diukur menggunakan densicheck sampai 0,5 sesuai dengan larutan standar 0,5 Mac Farland 1,5.10
8
CFUml.
b. Uji daya antibakteri ekstrak etanol daun beluntas dan daun
kemangi terhadap Staphylococcus epidermidis dengan metode
difusi sumuran
Pengujian daya antibakteri dengan metode difusi sumuran menggunakan 2 macam kontrol, yaitu kontrol media dan kontrol
pertumbuhan bakteri uji. Pembuatan kontrol media yaitu dengan menuang 30 ml MHA
pada petri sampai memadat kemudian dibuat sumuran lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji yaitu pertama dibuat base layer menggunakan MHA 5 ml
tanpa inokulasi bakteri. Setelah memadat, di atas base layer ditambahkan seed layer menggunakan MHA 25 ml yang sebelumnya
telah ditambahkan dengan 2 ml suspensi bakteri uji dan dibiarkan memadat lagi untuk kemudian dibuat sumuran. Petri diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 18-24 jam.
1 Penanaman isolat Staphylococcus epidermidis secara pour
plate
Media yang akan digunakan dibagi menjadi 2 bagian dengan perbandingan volume 1:5. Satu bagian 5 ml berupa
MHA steril tanpa inokulasi bakteri digunakan sebagai base layer, dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat
terlebih dahulu. Lima bagian 25 ml digunakan sebagai seed layer
yang dituang ke atas base layer setelah diinokulasi dengan bakteri uji.
Untuk layer atas, diambil 2 ml dari stok suspensi bakteri uji yang sudah disetarakan sesuai dengan larutan standar 0,5 Mac
Farland kemudian diinokulasikan ke media MHA secara pour plate
. Media MHA yang mengandung bakteri dibiarkan sampai memadat.
2 Inokulasi ekstrak etanol daun beluntas dan daun kemangi
dengan metode difusi sumuran
Media agar yang telah diinokulasikan dengan 2 ml suspensi Staphylococcus epidermidis dibuat 5-6 sumuran.
Pembuatan sumuran hanya menembus seed layer. Base layer digunakan sebagai alas agar ekstrak tidak menyebar pada dasar
cawan petri. Pada pengujian pertama digunakan konsentrasi ekstrak 10, 15, 20, 15 untuk masing-masing ekstrak, dan
pengujian dilanjutkan dengan konsentrasi 30, 35, 40, 45, 50. Semua konsentrasi ekstrak diinokulasikan pada sumuran yang
telah dibuat. Masing-masing petri juga diinokulasikan dengan kontrol pelarut etanol 70. Volume inokulasi sebesar 50 µ l.
Kontrol positif yang digunakan adalah Mediklin
®
Klindamisin fosfat 1,2 dengan konsentrasi 2 dan petri diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 18-24 jam dan diukur diameter zona hambatnya menggunakan penggaris.
c. Penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi padat
Pada uji ini menggunakan 3 macam kontrol, yaitu kontrol media, kontrol pertumbuhan bakteri uji dan kontrol pelarut etanol
70. Kontrol media dibuat dengan menuang 15 ml media MHA pada petri. Kontrol pertumbuhan bakteri uji dibuat dengan menambahkan 1
ml bakteri uji ke dalam15 ml media MHA kemudian dituang ke petri. Kontrol pelarut dibuat dengan mencampur pelarut ekstrak yaitu 1 ml
etanol 70 dan 1 ml bakteri uji dengan 15 ml media MHA kemudian dituang ke petri. Semua petri diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam.
1 Uji daya antibakteri dengan dilusi padat
Uji ini menggunakan 1 ml ekstrak daun beluntas dan ekstrak daun kemangi dengan masing-masing konsentrasi 5, 7,5,
10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ditambahkan dengan 1 ml suspensi bakteri uji yang sudah setara dengan larutan standar
0,5 Mac Farland dan 15 ml media MHA kemudian dituang ke petri. Petri diinkubasi pada suhu 37
o
C, diamati setelah 18-24 jam.
Kekeruhan media yang menunjukkan kepadatan pertumbuhan bakteri uji diamati, diberi penilaian menggunakan notasi +
untuk media yang agak keruh, ++ keruh, +++ sangat keruh dan notasi - jika tidak ada kekeruhan yang menandakan tidak ada
pertumbuhan dari bakteri uji dalam media tersebut. Kekeruhan masing-masing perlakuan dibandingkan dengan kontrol media
dan kontrol pertumbuhan bakteri uji.
2 Penentuan nilai KHM dan KBM
Pengujian selanjutnya dilakukan dengan menentukan nilai KHM dan KBM. Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan
dengan melakukan streak plate dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Hasil uji yang digunakan adalah media yang
menunjukkan kejernihan secara visual dan selanjutnya di-streak pada media MHA kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. KHM adalah kadar terkecil yang dapat menghambat
bakteri uji, ditandai dengan Staphylococcus epidermidis masih dapat tumbuh pada hasil streak plate, sedangkan KBM adalah
kadar terkecil yang dapat membunuh bakteri uji, ditandai dengan Staphylococcus epidermidis
sudah tidak dapat tumbuh pada hasil streak plate
yang menandakan bakteri uji mati karena senyawa uji pada konsentrasi tersebut.
F. Analisis Data
Data diameter zona hambat pada difusi sumuran dianalisis menggunakan program R 2.14.1, distribusinya diuji dengan Shapiro-Wilk. Jika normal diuji
kesamaan variannya dengan Levene’s test dan jika hasilnya memiliki kesamaan
varian maka dilanjutkan dengan One Way Anova. Data yang tidak terdistribusi normal dianalisis menggunakan Kruskal-Wallis untuk mengetahui ada tidaknya
perbedaan tiap kelompok perlakuan dan dilanjutkan dengan analisis Post-Hoc yaitu uji Wilcoxon untuk mengetahui kelompok yang mempunyai perbedaan.
Data uji antibakteri dengan dilusi padat didapat dengan melihat kekeruhan media secara visual dan dianalisis dengan deskriptif. Nilai KHM dan
KBM didapat dari hasil penegasan dengan metode streak plate.
27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman beluntas dan kemangi dilakukan untuk menghindari kesalahan dalam penelitian dan memastikan bahwa tanaman yang akan digunakan
adalah benar-benar Pluchea indica Less dan Ocimum basilicum L. Hasil yang didapat adalah benar kedua tanaman tersebut adalah Pluchea indica Less dan
Ocimum basilicum L sesuai dengan hasil determinasi pada lampiran 1.
B. Pengumpulan, Pengeringan dan Pembuatan Serbuk Bahan
Daun beluntas yang sudah kering diperoleh dari Merapi Farma Herbal kemudian dipisahkan antara daun dengan batang yang masih tercampur. Kemangi
segar diperoleh dari pasar Beringharjo, daun dipisahkan dari bagian yang lain kemudian dicuci dengan air bersih mengalir untuk menghilangkan pengotor yang
mungkin tercampur dan diangin-anginkan. Tujuan mengangin-anginkan ini untuk menghilangkan air sehingga daun tidak akan mudah membusuk dan senyawa aktif
yang diinginkan masih tetap ada dan tidak berubah. Daun kemangi yang sudah tidak mengandung air kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu ± 50
o
C selama ± 24 jam atau sampai daun sudah bisa hancur saat digenggam. Tujuan
pengeringan dengan oven ini untuk memaksimalkan proses pengeringan sehingga daun akan lebih mudah diserbuk. Selain itu pengeringan bertujuan mencegah
tumbuhnya kapang atau mikrobia lain. Daun beluntas ataupun daun kemangi masing-masing diserbuk dan diayak. Tujuan penyerbukan ini untuk memperluas
Kategori