Persiapan Inokulum Cendawan Analisis Data

3.3.1 Persiapan Inokulum Cendawan

Fusarium sp. IPBCC. 08.569 diperoleh dari bagian batang pohon yang wangi dan dengan lubang gerekan serangga. Pohon gaharu berasal dari desa Pasir Garam, Kabupaten Bangka Tengah. Isolat tersebut diremajakan pada media agar dekstrosa kentang dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Isolat akan digunakan sebagai sumber inokulum untuk mempelajari proses patogenesis cendawan meliputi proses kolonisasi dan respon tanaman terhadap kolonisasi cendawan.

3.3.2 Pengamatan Proses Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569

3.3.2.1 Mekanisme Penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569

Mekanisme penetrasi mencakup aktivitas penetrasi secara fisik, enzimatik, dan toksisitas. Mekanisme penetrasi secara fisik diamati dengan kemungkinan terbentuknya struktur khusus penetrasi seperti apresorium, pengamatan enzimatik mencakup uji lignoselulolitik. Sedangkan uji toksisitas berhubungan dengan gejala hipersensitifitas terhadap ekstrak kasar toksin. Kemampuan Perkecambahan Konidia dan Pembentukan Apresorium Konidia cendawan diperoleh dari isolat yang berumur 7 hari pada media MEA Lampiran 1. Sebanyak ±10 ml air steril dituang di atas kultur tersebut. Cawan selanjutnya digoyangkan selama 1 jam. Suspensi yang berisi konidia cendawan dimasukkan ke dalam falkon 15 ml dan divortek selama ±1 menit. Suspensi selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 10.000 xg selama 10 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dibuang dan pelet konidia diresuspensikan dengan penambahan 5 ml akuades steril. Jumlah konidia diatur sampai konsentrasi konidia berkisar 1-3x10 5 ml. Perkecambahan konidia dan terbentuknya apresorium diuji mengikuti metode Lee Bostock 2006 yang dimodifikasi. Pengamatan terhadap perkecambahan konidia dan pembentukan apresorium dilakukan dengan cara mengoleskan suspensi konidia ke bagian kulit kayu tanaman Aquilaria sp. sehat yang telah disterilisasi permukaannya. Kulit kayu disayat selanjutnya diletakkan di dalam cawan petri steril yang telah berisi kertas tissue basah. Pengamatan terbentuknya apresorium juga diamati dengan cara meletakan sebanyak 3-5 tetes suspensi konidia di atas gelas objek. Pengamatan terbentuknya apresorium dilakukan 2, 4, 6, 8, dan 24 jam setelah inkubasi. Sebelum pengamatan, kulit kayu yang diberi perlakuan konidia direndam dengan biru tripan selama 20-30 menit, sedangkan konidia yang di atas gelas objek ditetesi dengan biru tripan. Kemudian diamati menggunakan mikroskop cahaya. Uji Aktivitas Enzimatik Aktifitas enzimatik yang diamati meliputi aktifitas lignolitik dan selulolitik. Aktifitas lignolitik diuji secara kualitatif sedangkan aktifitas selolitik dipelajari secara kualitatif dan kuntitatif. Aktivitas lignolitik yang diuji mencakup kemampuan cendawan dalam menghasilkan enzim polifenol oksidase, lakase, dan tirosinase mengikuti metode Gramms et al. 1998. Sedangkan aktivitas selulolitik yang diuji adalah kemampuan cendawan dalam menghasilkan enzim endoglukonase CMC-ase. Enzim polifenol oksidase dideteksi dengan cara menumbuhkan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 pada media MEA dengan penambahan asam galat 0,05 MEAG atau dengan penambahan asam tanat 0,05 MEAT selama 7 hari pada suhu ruang. Terbentuknya warna coklat di bawah dan di sekitar koloni menunjukkan bahwa isolat bereaksi Bavedamm positif atau menghasilkan enzim polifenol oksidase. Sedangkan deteksi adanya lakase dan tirosinase dilakukan dengan melihat perubahan warna berturut-turut setelah penetesan 1-2 tetes 0,1 M 1-naftol pada posisi pukul 12 dan 1-2 tetes 0,1 M p-kresol pada posisi pukul 6 pada koloni isolat uji umur 7 hari pada media MEA yang diinkubasi pada suhu ruang. Perubahan warna diamati 1 jam dan 24 jam setelah penetesan. Terjadinya perubahan warna koloni dan medium di sekitar tempat penetesan 1-naftol menjadi biru sampai ungu menandakan terbentuknya lakase. Jika terbentuk merah orange sampai coklat setelah penetesan p-kresol menandakan terbentuknya tirosinase. Aktivitas selulolitik diuji secara kualitatif mengikuti metode Teather Petter 1987. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 ditumbuhkan pada media agar CMC 1 Lampiran 1 dalam dua tahapan dan masing-masing dalam tahapan penumbuhan, kultur diinkubasi pada suhu ruang selama 4 hari. Aktivitas selulolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih pada medium tersebut. Zona jernih yang terbentuk divisualisasikan dengan cara menuangkan pewarna merah kongo 0,1 selama 15 menit. Kemudian zat warna dibuang dan medium dibanjiri dengan 1M NaCl selama 15 menit. Pada saat ini zona bening akan tampak, sedangkan di luar zona jernih medium akan bewarna merah. Analisis kuantitatif aktivitas selulolitik dilakukan dengan dua tahap yaitu persiapan ekstrak kasar enzim dan asai enzim. Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan menanamkan 3 potongan inokulum dengan diameter 0.5 cmpotongan pada 100 ml medium cair CMC 1 dengan pH 7 di dalam erlenmeyer 250 ml. Inokulum berasal dari biakan yang ditumbuhkan dalam medium agar CMC 1 yang berumur 7 hari. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang di dalam mesin penggoyang selama 7 hari. Filtrat biakan disaring dengan kertas saring Whatman no 1. Filtrat hasil saringan kemudian disentrifugasi dua kali dengan kecepatan 10.000 xg selama 10 menit, suhu 4 o C. Filtrat yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk asai enzim CMC-ase. Aktivitas CMC-ase diuji mengikuti metode Miller 1959. Sebanyak 0,5 ml filtrat ditempatkan dalam tabung reaksi 21 x 1.5 cm dan dicampur dengan 0,5 ml larutan CMC 1 dalam buffer posfat pH 7.5 Lampiran 1, diinkubasi selama 60 menit pada suhu 30 o C. Selanjutnya reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml DNS Lampiran 1 dan diinkubasikan selama 15 menit pada suhu 100 o C. Absorbansi kemudian dibaca pada panjang gelombang 540 nm dengan spektrofotometer. Konsentrasi CMC-ase yang dihasilkan diperoleh melalui konversi absorbansi dengan menggunakan kurva standar glukosa Lampiran 2. Aktivitas CMC-ase dinyatakan dalam unit per ml filtrat. Satu unit setara dengan satu mikromol glukosa yang dihasilkan selama 1 jam. Uji Hipersensitif Toksin Uji hipersensitifitas ekstrak kasar toksin dilakukan pada daun tembakau yang telah berumur ±4 bulan. Pertama-tama ekstrak kasar toksin diproduksi dengan cara menumbuhkan sebanyak tiga potong koloni cendawan dengan diameter 0.5 cmpotongan di dalam erlenmeyer yang telah berisi 100 ml media cair dekstrosa kentang. Kemudian cendawan diinkubasi pada suhu 28 o C, sambil digoyang dengan kecepatan 121 rpm selama 7 hari. Filtrat biakan disaring dengan kertas saring Whatman no 1. Filtrat hasil saringan kemudian disentrifugasi dua kali dengan kecepatan 5.000 xg selama 15 menit, suhu 4 o C. Filtrat yang terbukti bebas dari konidia cendawan selanjutnya siap digunakan untuk uji aktivitas toksin. Sebanyak ±1 ml filtrat yang telah bebas konidia cendawan dioleskan ke permukaan daun tembakau steril. Tanaman yang telah diberi perlakuan disungkup menggunakan plastik bening selama 2 hari. Setelah dua hari tutup plastik dibuka dan tanaman dibiarkan kembali tumbuh pada lingkungan biasa. Aktivitas toksin yang dihasilkan diamati secara visual dengan timbulnya gejala nekrosis pada permukaan daun yang diberi perlakuan. Sebagai kontrol digunakan daun yang hanya dioles dengan media cair dekstrosa kentang tanpa biakan isolat dan daun sehat tanpa perlakuan. Toksisitas dinyatakan sebagai rataan skor Tabel 1. Tabel 1 Cara penilaian aktivitas hipersensitifitas toksin Skor Gejala tidak adanya gejala nekrosis 1 kurang dari setengah luas permukaan daun yang mengalami nekrosis 2 lebih dari setengah luas permukaan daun yang mengalami nekrosis.

3.3.2.2 Analisis Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569

Analisis kolonisasi dilakukan dengan dua cara yaitu dengan menggunakan pewarna biru tripan dan SEM. Analisis kolonisasi cendawan diamati pada daerah kayu yang diinokulasi dan di luar daerah inokulasi di atas dan di bawah kayu yang diinokulasi pada 7, 14, dan 21 hari setelah inokulasi 7, 14, dan 21 hsi. Inokulasi Cendawan ke Batang Aquilaria sp. Sebelum pengamatan kolonisasi, Fusarium sp. IPBCC. 08.569 diinokulasikan pada batang bibit Aquilaria sp. sehat, umur ±1 tahun dengan diameter ±0,5 cm, dan tinggi ±30 cm. Bagian batang yang akan diinokulasi dilukai sepanjang ±2 cm dengan membuang setengah dari kulit dan kambium batang. Seluruh permukaan batang yang telah dilukai selanjutnya ditempel dengan isolat uji, dilapisi dengan kapas basah, dan terakhir dibalut dengan selotip. Sebagai pembanding digunakan batang tanaman yang hanya dilukai tanpa diberi perlakuan sebagai kontrol positif dan tanaman yang sehat sebagai kontrol negatif. Inokulasi dilakukan pada 10 tanaman. Pewarnaan Menggunakan Biru Tripan Bagian kayu yang telah diinokulasi, kayu yang dilukai, dan kayu tanaman sehat dipotong dengan ukuran ± 0.5x0.5x0.5 cm. Kemudian kayu dicuci dengan akuades. Potongan kayu selanjutnya dibekukan pada suhu -18 o C sebelum disayat secara melintang dan membujur dengan mikrotom beku Yamato RV-240. Proses pewarnaan biru tripan dilakukan mengikuti metode Kormanick McGraw 1982. Sayatan kayu direndam dalam larutan KOH 10 vv pada suhu 90 o C selama 30 menit dan direndam kembali pada suhu ruang selama 24 jam. Apabila selama proses tersebut kolonisasi cendawan masih belum bisa diamati, maka perendaman diperpanjang sampai kolonisasi cendawan dapat dibedakan dengan sel tanaman. KOH dibuang dan sisanya dihilangkan dengan membilas sebanyak 3 kali dengan akuades steril. Sayatan kayu direndam dalam larutan HCl 1N selama 2-3 jam. kemudian diwarnai dengan pewarna biru tripan 0.05 Lampiran 1 selama 20-30 menit dan disimpan dalam larutan gliserin 50 Kormik Graw 1982. Sayatan yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop cahaya Nikon Afx-dx dan Nikon Obtiphot 2. Proses kolonisasi yang terjadi selanjutnya didokumentasikan menggunakan kamera digital. Pengamatan di bawah Mikroskop Pemindai Elektron SEM Bagian kayu yang telah diinokulasi 7, 14, dan 21 hsi, kayu yang dilukai, dan kayu tanaman sehat dipotong sepanjang ±1 cm. Bagian kayu tersebut selanjutnya siap untuk dipreparasi. Preparasi diawali dengan membersihkan kayu di dalam caccodylate buffer ± 2 jam, kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan proses prefiksasi dengan cara merendam kayu di dalam larutan glutaraldehyde 2.3 selama 2 hari. Sedangkan proses fiksasi dilakukan dengan cara merendam kayu di dalam tannic acid 2 selama 6 jam, kemudian sampel dicuci 4 kali dengan caccodylate buffer selama 5 menit. Proses selanjutnya adalah proses dehidrasi, kayu secara bertahap direndam 4 kali di dalam alkohol 50 selama 5 menit, 1 kali di dalam alkohol 70 selama 20 menit, 1 kali di dalam alkohol 85 selama 20 menit, 1 kali di dalam alkohol 95 selama 20 menit, dan 2 kali di dalam alkohol absolut selama 10 menit. Terakhir dilakukan proses pengeringan dengan cara merendam kayu dua kali di dalam tert butanol selama 10 menit, dibekukan di dalam freezer sampai beku, dan terakhir dimasukkan ke dalam freezed drier sampai kering. Kayu yang sudah kering diletakan di atas batang besi, kemudian bagian permukaan batang yang diinokulasi dan dilukai dilapisi dengan emas dalam technic Hummer V sputter coater. Pengamatan pada bagian dalam kayu yang terinfeksi dilakukan dengan membuang bagian permukaan kayu yang diinokulasi menggunakan mikrotom beku, kemudian dilapisi kembali dengan emas tanpa preparasi kembali. Selanjutnya struktur cendawan yang terdapat pada kayu yang terinfeksi diamati menggunakan mikroskop elektron model JSM 5000 LV yang dioperasikan pada tegangan 20 kv. Pengamatan menggunakan SEM dilakukan di laboratorium mikroskop SEM, Zoologi LIPI Cibinong.

3.3.3 Respon Aquilaria sp. terhadap Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569

Respon tanaman terhadap isolat uji diamati dengan melihat gejala yang ditimbulkan setelah inokulasi. Gejala yang terjadi pada tingkat seljaringan diamati dengan uji histokimia. Sedangkan gejala yang teramati pada tingkat organ dinyatakan dalam bentuk rataan skor. Pengamatan terhadap gejala yang ditimbulkan diamati 7, 14, dan 21 hsi.

3.3.3.1 Uji Histokimia

Uji histokimia yang diamati meliputi uji terpenoid dan pati. Bagian kayu yang telah diinokulasi dan daerah perubahan warna dipotong secara melintang menggunakan mikrotom beku Yamato RV-240. Sayatan kayu kemudian direndam dalam larutan tembaga asetat 50 selama 30 menit untuk uji terpenoid Martin et al. 2002. Sayatan selanjutnya diletakkan di atas gelas objek dan ditetesi dengan larutan gliserin 50. Sedangkan untuk pengamatan pati, sayatan ditetesi dengan larutan I 2 KI 1 tanpa perendaman dengan larutan tembaga asetat 50. Selanjutnya preparat diamati di bawah mikroskop cahaya. Sebagai kontrol digunakan sayatan batang tanaman yang hanya dilukai kontrol positif dan batang tanaman sehat kontrol negatif.

3.3.3.2 Gejala Luar

Gejala luar yang diamati pada tingkat organ berupa klorosis daun, perubahan warna kayu pada daerah terinfeksi, dan adanya aroma wangi yang dinyatakan dalam sistem skor 0-10 Tabel 2. Selanjutnya dinyatakan dalam bentuk rataan skor pada setiap pengamatan. Tabel 2 Sistem skor respon Aquilaria sp. terhadap inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Nilai Gejala Daun Warna Kayu Wangi tidak klorosisklorosis putih tidak wangi 1 tidak klorosisklorosis putih kecoklatan tidak wangi 2 tidak klorosisklorosis coklat tidak wangi 3 klorosis putih kecoklatan agak wangi 4 tidak klorosis putih kecoklatan agak wangi 5 klorosis coklat agak wangi 6 tidak klorosis coklat agak wangi 7 klorosis putih kecoklatan wangi 8 tidak klorosis putih kecoklatan wangi 9 klorosis coklat wangi 10 tidak klorosis coklat wangi Rumus rataan skor adalah sebagai berikut : Keterangan : Xn = Tanaman ke –n Skor yang diperoleh menunjukkan tingkat pembentukan gaharu. Tingkat pembentukan gaharu dinyatakan dalam 3 kategori Tabel 3. Tabel 3 Kategori tingkat pembentukan gaharu Kategori skor Tingkat pembentukan gubal gaharu 1 7-10 gaharu sudah terbentuk 2 3-6 gaharu mulai terbentuk 3 0-2 gaharu tidak terbentuk Selain melakukan pengamatan terhadap perubahan warna kayu, pengamatan juga dilakukan terhadap pertambahan panjang dan dalam zona perubahan warna. Pertambahan panjang zona perubahan warna adalah panjang kayu yang mengalami pertambahan panjang perubahan warna ke arah tajuk atas atau ke arah akar bawah dari daerah yang diinokulasi atau dilukai. Kulit kayu di sisi atas dan bawah daerah yang diinokulasi dan dilukai dikupas dan panjang perubahan warnanya diukur. Sedangkan kedalaman perubahan warna diamati pada sayatan melintang daerah yang diinokulasi atau dilukai.

3.3.4 Analisis Data

Data hasil pengamatan panjang dan dalam zona perubahan warna dianalisis dengan perangkat lunak SAS versi 9.1 menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL satu faktor dan RAL dengan waktu serta diuji F pada α = 5. Bila terdapat pengaruh nyata dari perlakuan yang diamati maka setiap taraf perlakuan dibandingkan dengan menggunakan uji lanjut Duncan pada taraf 5. IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Proses Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569

Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak membentuk apresorium di permukaan kulit kayu Aquilaria sp utuh. Konidia membentuk tabung kecambah pada jam ke- 6 Gambar 2a dan terus memanjang membentuk hifa pada jam ke-8 Gambar 2b. Pengamatan pada jam ke-24 memperlihatkan adanya kumpulan miselium di permukaan kulit kayu Gambar 2c. Kulit kayu Aquilaria sp. tidak memiliki lentisel dan hifa tidak ditemukan menembus permukaan kulit kayu. Gambar 2 Perkecambahan konidia Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di permukaan kulit kayu Aquilaria sp utuh. Konidia berkecambah kb. a 6 jam, b 8 jam, dan c 24 jam. Pada uji perkecambahan konidia secara in vitro di atas gelas objek, konidia belum berkecambah pada jam ke-0. Konidia baru mulai menunjukkan adanya perkecambahan pada jam ke-4, dan tabung kecambah terus memanjang membentuk hifa pada jam ke-6 dan ke-8. Jumlah konidia yang berkecambah sebesar 2.92 pada jam ke-4. Sampai pengamatan jam ke-8 persentase perkecambahan konidia meningkat, namun hanya mencapai 5.42 Gambar 3. Sama halnya dengan pengamatan perkecambahan konidia pada permukaan kulit kayu, apresorium juga tidak terbentuk di atas gelas objek. Gambar 3 Persentase perkecambahan konidia Fusarium sp. IPBCC. 08.569 5 µm 5 µm 5 µm Miselium kb hifa a b c