kertas saring Whatman no 1. Filtrat hasil saringan kemudian disentrifugasi dua kali dengan kecepatan 5.000 xg selama 15 menit, suhu 4
o
C. Filtrat yang terbukti bebas dari konidia cendawan selanjutnya siap digunakan untuk uji aktivitas
toksin. Sebanyak ±1 ml filtrat yang telah bebas konidia cendawan dioleskan ke
permukaan daun tembakau steril. Tanaman yang telah diberi perlakuan disungkup menggunakan plastik bening selama 2 hari. Setelah dua hari tutup plastik dibuka
dan tanaman dibiarkan kembali tumbuh pada lingkungan biasa. Aktivitas toksin yang dihasilkan diamati secara visual dengan timbulnya gejala nekrosis pada
permukaan daun yang diberi perlakuan. Sebagai kontrol digunakan daun yang hanya dioles dengan media cair dekstrosa kentang tanpa biakan isolat dan daun
sehat tanpa perlakuan. Toksisitas dinyatakan sebagai rataan skor Tabel 1. Tabel 1 Cara penilaian aktivitas hipersensitifitas toksin
Skor Gejala
tidak adanya gejala nekrosis 1
kurang dari setengah luas permukaan daun yang mengalami nekrosis 2
lebih dari setengah luas permukaan daun yang mengalami nekrosis.
3.3.2.2 Analisis Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569
Analisis kolonisasi dilakukan dengan dua cara yaitu dengan menggunakan pewarna biru tripan dan SEM. Analisis kolonisasi cendawan diamati pada daerah
kayu yang diinokulasi dan di luar daerah inokulasi di atas dan di bawah kayu yang diinokulasi pada 7, 14, dan 21 hari setelah inokulasi 7, 14, dan 21 hsi.
Inokulasi Cendawan ke Batang Aquilaria sp.
Sebelum pengamatan
kolonisasi, Fusarium
sp. IPBCC.
08.569 diinokulasikan pada batang bibit Aquilaria sp. sehat, umur ±1 tahun dengan
diameter ±0,5 cm, dan tinggi ±30 cm. Bagian batang yang akan diinokulasi dilukai sepanjang ±2 cm dengan membuang setengah dari kulit dan kambium
batang. Seluruh permukaan batang yang telah dilukai selanjutnya ditempel dengan isolat uji, dilapisi dengan kapas basah, dan terakhir dibalut dengan selotip.
Sebagai pembanding digunakan batang tanaman yang hanya dilukai tanpa diberi
perlakuan sebagai kontrol positif dan tanaman yang sehat sebagai kontrol negatif. Inokulasi dilakukan pada 10 tanaman.
Pewarnaan Menggunakan Biru Tripan
Bagian kayu yang telah diinokulasi, kayu yang dilukai, dan kayu tanaman sehat dipotong dengan ukuran ± 0.5x0.5x0.5 cm. Kemudian kayu dicuci dengan
akuades. Potongan kayu selanjutnya dibekukan pada suhu -18
o
C sebelum disayat secara melintang dan membujur dengan mikrotom beku Yamato RV-240.
Proses pewarnaan biru tripan dilakukan mengikuti metode Kormanick McGraw 1982. Sayatan kayu direndam dalam larutan KOH 10 vv pada
suhu 90
o
C selama 30 menit dan direndam kembali pada suhu ruang selama 24
jam. Apabila selama proses tersebut kolonisasi cendawan masih belum bisa diamati, maka perendaman diperpanjang sampai kolonisasi cendawan dapat
dibedakan dengan sel tanaman. KOH dibuang dan sisanya dihilangkan dengan membilas sebanyak 3 kali dengan akuades steril. Sayatan kayu direndam dalam
larutan HCl 1N selama 2-3 jam. kemudian diwarnai dengan pewarna biru tripan 0.05 Lampiran 1 selama 20-30 menit dan disimpan dalam larutan gliserin 50
Kormik Graw 1982. Sayatan yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop cahaya Nikon Afx-dx dan Nikon Obtiphot 2. Proses kolonisasi yang terjadi
selanjutnya didokumentasikan menggunakan kamera digital.
Pengamatan di bawah Mikroskop Pemindai Elektron SEM
Bagian kayu yang telah diinokulasi 7, 14, dan 21 hsi, kayu yang dilukai, dan kayu tanaman sehat dipotong sepanjang ±1 cm. Bagian kayu tersebut selanjutnya
siap untuk dipreparasi. Preparasi diawali dengan membersihkan kayu di dalam caccodylate buffer ± 2 jam, kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner selama 5
menit. Selanjutnya dilakukan proses prefiksasi dengan cara merendam kayu di dalam larutan glutaraldehyde 2.3 selama 2 hari. Sedangkan proses fiksasi
dilakukan dengan cara merendam kayu di dalam tannic acid 2 selama 6 jam, kemudian sampel dicuci 4 kali dengan caccodylate buffer selama 5 menit. Proses
selanjutnya adalah proses dehidrasi, kayu secara bertahap direndam 4 kali di dalam alkohol 50 selama 5 menit, 1 kali di dalam alkohol 70 selama 20 menit,
1 kali di dalam alkohol 85 selama 20 menit, 1 kali di dalam alkohol 95 selama
20 menit, dan 2 kali di dalam alkohol absolut selama 10 menit. Terakhir dilakukan proses pengeringan dengan cara merendam kayu dua kali di dalam tert butanol
selama 10 menit, dibekukan di dalam freezer sampai beku, dan terakhir dimasukkan ke dalam freezed drier sampai kering.
Kayu yang sudah kering diletakan di atas batang besi, kemudian bagian permukaan batang yang diinokulasi dan dilukai dilapisi dengan emas dalam
technic Hummer V sputter coater. Pengamatan pada bagian dalam kayu yang terinfeksi dilakukan dengan membuang bagian permukaan kayu yang diinokulasi
menggunakan mikrotom beku, kemudian dilapisi kembali dengan emas tanpa preparasi kembali. Selanjutnya struktur cendawan yang terdapat pada kayu yang
terinfeksi diamati menggunakan mikroskop elektron model JSM 5000 LV yang dioperasikan pada tegangan 20 kv. Pengamatan menggunakan SEM dilakukan di
laboratorium mikroskop SEM, Zoologi LIPI Cibinong.
3.3.3 Respon Aquilaria sp. terhadap Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569
