1
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Enzim arabinosa isomerase AI dapat mengkatalisis secara revesible reaksi isomerisasi D-galaktosa menjadi D-tagatosa Lee et al 2004. Tagatosa telah
digunakan sebagai pemanis rendah kalori 1,5 kkalg Levin 2002. Tagatosa memiliki tingkat kemanisan 92 dibandingkan sukrosa Lee et al 2004.
Tagatosa memberikan berbagai manfaat kesehatan diantaranya seperti menurunkan berat badan, prebiotik, anti-histolisis Oh 2007 serta mereduksi
sejumlah gejala yang berhubungan dengan diabetes tipe 2, hiperglikemia, obesitas, anemia dan hemophilia Levin 2002; Lu et al 2007. Peran tagatosa
sebagai antidiabetes akan bermanfaat sebagai gula alternatif di Indonesia, mengingat Indonesia menempati peringkat ke-4 dengan jumlah penderita diabetes
terbesar di dunia Wild et al 2004. Produksi tagatosa dalam bentuk bulk sweeteners telah dilakukan pada skala
industri secara kimiawi menggunakan katalis kalsium Beadle et al 1991. Tahapan-tahapan dan proses purifikasi yang kompleks, limbah kimia, serta
produk akhir lainnya yang dihasilkan yang bukan tagatosa by-product menyebabkan penggunaan katalis kimia mulai ditinggalkan. Alternatif yang saat
ini banyak digunakan adalah menggunakan katalis biologis seperti enzim. Sorbitol dehidrogenase dari sejumlah mikroorganisme awalnya dipelajari untuk
memproduksi D-tagatosa
dari galaktitol.
D-psicosa 3-epimerse
dari Agrobacterium tumefaciens dan D-tagatosa 3-epimerase dari Pseudomonas
cichorii ternyata diketahui dapat membentuk tagatosa dari D-sorbosa. Namun substrat galaktitol ataupun D-sorbosa yang mahal menyebabkan pengembangan
enzim ini tidak efisien Oh 2007. Enzim yang saat ini paling banyak dicari untuk memproduksi tagatosa
adalah enzim arabinosa isomerase AI. Pembentukan tagatosa dari galaktosa ini sangat efisien karena substrat yang dibutuhkan dan tahapan produksinya. Studi
produksi dan pencarian enzim AI termostabil lebih difokuskan, sebab konversi D- galaktosa menjadi D-tagatosa meningkat dengan peningkatan suhu 50ºC
Kim et al 2002. Selain itu, enzim-enzim pangan yang bersifat termostabil juga
2 menjadi semakin penting dalam dunia industri. Hal ini berkaitan dengan
keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi, diantaranya adalah mengurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan reaksi
sehingga menghemat waktu, tenaga dan biaya, serta menurunkan viskositas larutan fermentasi sehingga memudahkan proses produksi. Suhu yang
direkomendasikan untuk aplikasi industri produksi tagatosa menggunakan enzim AI adalah 60-65ºC, karena pada suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan
terjadinya reaksi pengcoklatan Cheng et al 2009.
Sejumlah bakteri termofilik penghasil enzim AI telah dilaporkan. Beberapa diantaranya adalah Thermotoga neapolitana Kim et al 2002, Thermus sp. Kim
et al 2003b, Thermoanaerobacter mathranii Jorgensen et al 2004, Thermotoga maritima Lee et al 2004, Geobacillus stearothermophilus T6 Lee et al 2005a,
Alicyclobacillus acidocaldarius Lee et al 2005b, Bacillus stearothermophilus US100 Rhimi Bejar 2006, G. thermodenitrificans Kim Oh 2005, dan B.
stearothermophilus IAM11001 Cheng et al 2009. Produksi enzim AI yang berasal dari bakteri-bakteri termofilik tersebut diatas dilakukan dengan
menggunakan inang E. coli. Gen araA yang mengkode arabinosa isomerase AI dikloning melalui plasmid ke bakteri E. coli BL21. E. coli kemudian akan
Gambar 1. Ilustrasi produksi tagatosa dari laktosa menggunakan katalis
kalsium Skytte 2006
3 mengekspresikan atau menghasilkan enzim AI setelah diberi senyawa
penginduksi. E. coli merupakan salah satu mikroorganisme yang banyak digunakan untuk produksi protein rekombinan karena alasan-alasan berikut: 1 E.
coli dapat tumbuh dengan cepat, 2 suhu dan medium pertumbuhan lebih sederhana untuk mencapai massa sel yang tinggi, 3 karakteristik genetikanya
telah diketahui dengan baik, dan 4 E. coli memiliki vektor kloning yang lebih banyak Baneyx 1999.
Diantara beberapa bakteri termofilik yang diteliti, saat ini enzim AI yang berasal dari G. stearothermophilus Gali152 memiliki kemampuan tertinggi
dalam menghasilkan tagatosa dan produktivitasnya telah mendekati kriteria produksi untuk skala komersial Oh 2007. Kim et al 2003a melaporkan bahwa
teknik imobilisasi enzim AI dari G. stearothermophilus Gali152 dapat menghasilkan 230 gliter tagatosa dari 500 gramliter galaktosa dengan
produktivitas 319 gliter per hari pada sistem batch. Sedangkan fermentasi dengan sistem kontinu menghasilkan 145 gliter tagatosa dari 300 gliter galaktosa dengan
produktivitas 1,296 gliter per hari Ryu et al 2003. Fitriani dan Saksono 2010 telah melakukan kloning dan ekspresi gen araA
dari strain lokal G. stearothermophilus asal Tanjung Api, Poso, Indonesia. Analisis DNA homologi yang telah dilakukan menunjukkan bahwa AI dari G.
stearothermophilus lokal
memiliki nilai
kemiripan 98
dengan G.
stearothermophilus T6, 97 dengan B. stearothermophilus US100 dan A.
acidocaldarius , 96 dengan Thermus sp., 95 dengan B. stearothermophilus
IAM11001, dan G. thermodentrificans. Namun analisis dengan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE menunjukkan
level ekspresi enzim AI tersebut pada media ekspresi fermentasi Luria Bertani LB
masih rendah. Ekspresi gen araA ini perlu ditingkatkan sehingga jumlah enzim AI yang dihasilkan optimal.
Meskipun penggunaan E. coli sebagai inang untuk memproduksi arabinosa isomerase memiliki keunggulan, akan tetapi tidak menjamin bahwa protein
rekombinan yang ditargetkan terekpresikan dalam jumlah tinggi dan aktif. Apalagi suhu optimum bakteri asal berbeda dengan inang yang akan
mengekpresikan, sehingga dapat mempengaruhi pembentukan dan pelipatan
4 protein ataupun enzim. Kesalahan dalam pelipatan protein dapat menyebabkan
peningkatan ekspresi protein rekombinan yang tidak larut insoluble. Protein rekombinan yang tidak larut biasanya memiliki aktivitas yang rendah.
Peningkatan ekspresi protein rekombinan pada E.coli dapat dilakukan dengan modifikasi komponen medium ekspresi dan ini merupakan teknik yang paling
efisien Blommel et al 2007. Lama waktu induksi juga mempengaruhi tingginya ekpresi protein rekombinan pada bakteri E. coli Donovan et al 1996; Azaman et
al 2010. Penelitian yang telah dilakukan Putri 2010 menunjukkan bahwa limbah cair tahu yang ditambahkan ekstrak khamir dapat digunakan sebagai
medium pertumbuhan E.coli rekombinan dan ekspresi protein rekombinannya. Penggunaan limbah cari tahu sebagai medium ekspresi mempermudah tahapan
pemisahan protein aktif dengan inclusion body insoluble protein. Selain untuk meningkatkan produksi enzim, penelitian ini juga dilakukan
untuk memurnikan enzim yang telah diperoleh dan mengetahui karakteristik enzim AI dari G. stearothermophilus lokal. Karakteristik AI yang ingin diketahui
mencakup suhu dan pH optimum, logam aktivator dan stabilitas panas. Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh enzim AI dari isolat lokal atau sumber daya
alam Indonesia yang telah terkarakterisasi. Enzim yang dihasilkan dapat digunakan untuk memproduksi tagatosa. Karakteristik enzim AI dari strain lokal
ini dapat menjadi acuan untuk dibandingkan dengan enzim AI yang telah ada. Serta apakah enzim bisa langsung diterapkan pada skala industri atau diperlukan
teknik lainnya untuk meningkatkan karakteristik enzim.
B. TUJUAN
Kategori