32
116 kDa
B. PRODUKSI ENZIM ARABINOSA ISOMERASE
Produksi enzim AI dilakukan dengan memodifikasi medium ekspresi. Modifikasi medium ekspresi dilakukan karena enzim target yang diharapkan tidak
terekspresi secara maksimal pada medium ekspresi yang biasa digunakan yaitu media cair Luria Bertani LB. Pita yang masih tipis dari analisis SDS-PAGE
data tidak ditampilkan menunjukkan bahwa tidak diperolehnya kondisi overekspresi.
Berdasarkan penelitian Putri 2010 diketahui bahwa limbah cair tahu yang ditambahkan ekstrak khamir dan diatur pH-nya dapat digunakan sebagai medium
pertumbuhan dan medium ekspresi protein rekombinan. E. coli transfroman yang ditumbuhkan pada media limbah cair tahu dengan penambahan ekstrak kamir
0,5 mv memberikan level ekspresi yang tinggi. Penggunaan limbah cair tahu sebagai medium ekspresi lebih memudahkan tahapan pemisahan enzim target dari
protein membran setelah freeze-thaw dibandingkan medim LB.
~ 56 kDa
LB LCT+YE
Gambar 11. Perbandingan ekpresi enzim AI pada 2 jenis medium ekpresi
berbeda. Keterangan: LB = luria bertani, LCT+YE=limbah cair tahu + yeast extract, M=marker, ni= non induksi, t=total suspensi
sel, s2=supernatan 2, p2=pellet 2.
66.2 kDa
45 kDa
35 kDa 25 kDa
M ni t s2 p2 t s2 p2 ni
33 Dari analisis dengan SDS-PAGE gambar 11 telah terkonfirmasi bahwa
medium ekpresi yang lebih baik untuk produksi enzim arabinosa isomerase adalah limbah cair tahu yang ditambahkan ekstrak kamir LCT+YE. Media cair LB juga
dapat digunakan sebagai medium ekspesi, akan tetapi pita band enzim target yang dihasilkan sangat tipis dibandingkan dengan medium LCT + YE. Perlakuan
non induksi atau tanpa penambahan isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosidasei IPTG bertujuan agar lebih meyakinkan bahwa yang terekspresi dengan berat
molekul 56 kDa adalah enzim target. Sedangkan adanya running terhadap total, supernatant ke-2 dan pellet ke-2 agar diketahui bahwa enzim AI terdapat pada
supernatan. Sistem ekspresi protein rekombinan dengan inang E. coli BL21 dan plasmid
pET21b merupakan sistem ekspresi modern dan telah banyak diterapkan. Gen target yang dikloning pada plasmid pET21b berada pada posisi hilir downsteam
dari promoter atau T7 promoter. T7 promoter berada pada bagian hulu dari operator. T7 promoter ini hanya akan mengenali T7 RNA polimerase dari T7 faga
pada E. coli BL21 untuk memulai transkripsi gen target. Karena keberadaan represor pada operator masing-masing genom E. coli BL21 DE3 dan plasmid
pET menyebabkan kecil kemungkinan T7 RNA polimerase diproduksi. Meskipun diproduksi, plasmid pLysS yang mengkode T7 lisosim akan menginaktifkan T7
RNA polimerase sebelum bergabung dengan T7 promoter. Jika T7 lisosim tidak mampu juga menginaktifkan seluruh T7 RNA polimerase, maka keberadaan
represor pada operator pET akan menghambat transkripsi gen target Sambrook Russell 2001. Penambahan IPTG sebagai senyawa penginduksi akan
menyebabkan represor terlepas dari operator sehingga RNA polimerase diproduksi dan kemudian berikatan dengan T7 promoter Sorensen Mortensen
2005. Hal inilah yang menyebabkan tidak adanya enzim target yang dihasilkan apabila tidak diinduksi dengan IPTG. Oleh karena gen pengkode T7 RNA
polimerase berasal dari virus bakteri faga, maka proses transkripsi ini akan berlangsung dengan cepat dan T7 RNA polimerase diproduksi dalam jumlah
banyak.
34 Limbah cair tahu yang ditambahkan ekstrak khamir LCT+YE dapat
digunakan sebagai medium untuk memproduksi enzim AI asal Geobacillus stearothermophilus lokal menggunakan inang E. coli BL21 pLysS pET21b
dikarenakan medium ekspresi ini mengandung sumber carbon C, nitrogen N dan mineral yang dibutuhkan oleh bakteri transfroman tersebut. Limbah cair tahu
cukup potensial digunakan sebagai media fermentasi karena masih memiliki komponen nutrisi yang cukup lengkap bagi pertumbuhan mikroba Kawira 1993.
Limbah cair tahu mengandung 0.01 sumber karbon, 0.08 sumber nitrogen dan 27.5 mineral berupa kalsium, magnesium, besi, natrium, kalium, dan fosfor
Nurdin 1989. C dan N berguna sebagai sumber energi untuk metabolisme atau sintesis protein. Sedangkan mineral berfungsi sebagai kofaktor serta membantu
membawa nutrisi ke dalam sel. Pemilihan media fermentasi merupakan faktor yang sangat penting dalam
memproduksi enzim dari mikroba, disamping faktor lain seperti kondisi fermentasi dan spesies mikroorganisme Aunstrup 1979. Menurut Meyrath
Volvasek 1975, konsentrasi karbon murni yang rendah dan protein yang tinggi pada media akan meningkatkan produksi enzim dari mikroba. Ketika bakteri
diinokulasikan ke dalam medium, bakteri akan memanfaatkan karbon sebagai sumber energi untuk beradaptasi dengan medium. Setelah sumber karbon murni
habis atau tersisa sedikit, bakteri kemudian mulai mensintesis enzim-enzim yang dapat digunakan untuk menghidrolisis protein menjadi asam-asam amino. Asam-
Gambar 12 . Mekanisme ekspresi terinduksi IPTG pada inang E. coli BL21DE3
dengan sistem pET Sorensen Mortensen 2005
35 asam amino ini akan digunakan sebagai sumber energi oleh bakteri untuk
bertahan hidup dan melakukan replikasi. Limbah cair tahu diperkirakan masih mengandung sedikit sumber karbon
dari pati kedelai. Protein pada limbah cair tahu berasal dari kedelai. Dalam proses pembuatan tahu, pada proses ekstraksi dengan air panas, sekitar 79-82
kandungan protein kedelai dapat diekstrak. Dari protein yang terekstrak ini, pada waktu pengendapan tahu tidak semuanya mengendap. Banyaknya protein yang
dapat digumpalkan atau diendapkan tergantung pada jenis penggumpalnya. Karena tidak terekstraksinya dan terendapnya semua protein yang terdapat pada
kedelai, maka pada limbah cair tahu masih terdapat protein kedelai Nurdin 1989. Penambahan ekstrak khamir ke dalam media limbah cair tahu meningkatkan
kandungan nutrisi medium. Ekstrak khamir merupakan protein sel tunggal yang kaya akan asam amino, peptida, vitamin-vitamin B dan trace element. Ekstrak
khamir juga mengandung asam nukleat terutama RNA Singleton Sainsbury 2006.
Penelitian yang dilakukan oleh Nurdin 1989 menunjukkan bahwa limbah cair tahu lebih baik dalam menghasilkan enzim protease asal bakteri Bacillus
licheniformis BCC 0607 dibandingkan medium sintetis. Pada penelitian ini, medium LCT+YE lebih baik sebagai medium ekpresi enzim AI dibandingkan LB
karena LCT+YE mengandung mineral yang lebih lengkap. Natrium, kalium dan kalsium menjaga agar protein dan komponen nutrisi lainnya dapat secara simultan
dibawa ke dalam sel melalui mekanisme transpor aktif. Sedangkan magnesium Mg berfungsi sebagai kofaktor esensial dalam sintesis protein. Sintesis protein
oleh E. coli membutuhkan Mg untuk mengaktifkan asam amino dari poolnya, mengawali proses translasi initiation dan pada tahap pemanjangan elongation
menjadi oligopeptida atau protein Stader 1995; Prescott 2002. Kalsium juga diketahui dapat meningkatkan produksi enzim rekombinan pada E. coli BL21.
Penelitian yang telah dilakukan oleh Delgado 2009 menunjukkan bahwa level ekpresi protein rekombinan oleh E. coli BL21 secara jelas meningkat 15 lebih
tinggi pada medium LB yang ditambahkan kalsium Ca dibandingkan medium LB saja. Ca diduga berperan sebagai pembawa pesan intreseluler intracellular
messenger dalam sel prokariotik.
36
C. OPTIMASI PRODUKSI DENGAN LAMA WAKTU INDUKSI
Kategori