18 aktif enzim maupun substrat, dan 7 merubah konformasi enzim menjadi
konformasi yang lebih aktif Whitaker et al 2003. Beberapa jenis enzim mengandung ion logam yang telah terikat ataupun
memerlukan ion logam yang sengaja ditambahkan bagi aktivitasnya. Metaloenzim mengandung ion logam fungsional dalam jumlah pasti, yang dipertahankan
selama proses pemurnian. Enzim yang diaktifkan oleh logam memperlihatkan ikatan yang lebih lemah dengan logam, dan dengan demikian memerlukan logam
tambahan. Oleh karena itu, perbedaan metaloenzim dengan enzim yang diaktifkan oleh logam terletak pada afinitas suatu enzim tertentu terhadap ion logamnya
Bugg 2004. Seperti halnya katalisator, enzim dapat mempercepat reaksi kimia dengan
menurunkan energi aktivasinya. Kemampuan enzim merubah substrat menjadi produk disebut sebagai aktivitas enzim. Dengan persetujuan internasional, 1,0 unit
aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menyebabkan pengubahan 1,0 mikromol 10
-6
mol substrat per menit pada keadaan pengukuran optimal. Aktivitas spesifik adalah jumlah unit substrat yang dirubah per milligram enzim
Lehninger 1982.
E. SODIUM
DEDOSIL SULFAT
POLIAKRILAMID GEL
ELEKTROFORESIS SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE merupakan metode analisis protein secara kualitatif yang paling banyak
digunakan. Secara umum SDS-PAGE bermanfaat untuk menganalisis kemurnian protein. Dan karena dapat memisahkan protein berdasarkan ukuran, maka metode
ini juga dapat digunakan untuk menentukan berat molekul relatif protein Walker 2009. Elektroforesis adalah peristiwa perpindahan partikel-partikel bermuatan
karena pengaruh medan listrik. Pada tahapan SDS-PAGE, protein didenaturasi menggunakan panas, ß-merkaptoetanol, dan SDS. Protein yang terdenaturasi akan
bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif
ini akan dapat dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan
19 bantuan protein standar marker yang telah diketahui berat molekulnya melalui
perbandingan nilai mobilitas relatif Rf Lehninger 2004. Gel poliakrilamid tersusun atas monomer monoakrilamid yang membentuk
ikatan silang dengan bantuan ammonium persulfat APS dan N,N,N,N- tetramethylethylenediamine TEMED. Ukuran pori gel poliakrilamid bergantung
pada konsentrasi akrilamid. SDS-PAGE terdiri dari 2 gel yaitu stacking gels dan separating gels. Stacking gels memiliki kandungan akrilamid yang lebih rendah
sehingga memiliki pori yang lebih besar. Stacking gels berfungsi sebagai media agar protein terdenaturasi yang telah bermuatan negatif bergabung atau
berasosiasi membentuk elips masuk kedalam separating gel. Separating gels yang memiliki pori yang lebih kecil kemudian akan memisahkan protein berdasarkan
ukuran. Protein yang berukuran lebih kecil akan lebih cepat melewati pori-pori pada separating gels Walker 2009.
SDS-PAGE dilakukan dengan posisi berdiri, dimana pada bagian bawah gel diberi buffer anoda bermuatan positif dan dibagian atas gel diberi buffer katoda
bermuatan negatif. Kompleks protein-SDS yang telah bermuatan negatif akan bergerak melewati gel poliakrilamid menuju anoda dengan bantuan medan listrik
dan buffer elektroforesis. Laju pergerakan protein bergantung pada ukuran pori dan kekuatan medan listrik. Setelah dilakukan elektroforesis, gel divisualisasi
dengan pewarnaan. Pewarnaan protein dalam gel dapat dilakukan dengan pewarna Coomassie Brilliant Blue R-250 atau pewarna perak silverstain. Dengan
pewarnaan, protein dalam gel poliakrilamid akan terlihat membentuk band atau
pita yang terpisah berdasarkan ukurannya masing-masing Walker 2009. F. PENGUKURAN KONSENTRASI PROTEIN
Menurut Walker 2009, kuantifikasi protein dapat dilakukan dengan beberapa metode diantaranya adalah dengan: 1 absorbansi dengan sinar
ultraviolet UV absorption, 2 metode Lowry, 3
bicinchoninic acid BCA assay dan 4 metode Bradford.
Metode Bradford merupakan salah satu teknik penentuan kadar protein yang berdasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna
Coomassine Brilliant Blue G250 CBBG oleh protein pada kondisi pH asam. Grup trifenilmetana mengikat struktur non polar protein dan grup anion sulfonat
berinteraksi dengan rantai samping protein kation protein bermuatan positif.
20 Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang
ditemukan pada protein. Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan panjang gelombang
maks
465 nm, sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna
biru panjang gelombang
maks
595 nm. Bradford 1976. Pada metode Bradford, penentuan protein dapat dilakukan dengan cara
mikro untuk kandungan protein yang rendah dan makro untuk kandungan protein yang tinggi. Standar konsentrasi protein yang sesuai adalah 10-100
µg. Konsentrasi protein 0-10
µ g biasanya digunakan dalam pengujian mikro dan 10- 100
µg digunakan dalam pengujian makro. Karena lebih sederhana dan lebih sensitif, metode ini adalah yang paling banyak digunakan untuk analisis protein
secara kuantitatif Kruger 2009. Hubungan absorbansi dan konsentrasi protein ditentukan melalui kurva
standar yang telah dibuat sebelumnya. Penetapan kurva standar dilakukan dengan menggunakan protein tertentu seperti bovin serum albumin BSA, dengan
berbagai konsentrasi. Besarnya konsentrasi BSA sebagai protein standar adalah sekitar 150-750 µgml Coligan et al 2004. Hubungan antara konsentrasi larutan
standar dan absorbansinya dinyatakan sebagai persamaan regresi linier: Y = a + bx. Dalam analisis dengan metode bardford ini terdapat dua jenis metode yaitu
makro assay untuk konsentrasi protein tinggi dan mikro assay untuk konsentrasi
protein rendah Bradford 1976.
21
METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
