28 Gel dibiarkan mengering tetapi sebelumnya sumur pada gel telah dibuat.
Gel dipasang pada perangkat gel elektroforesis dengan posisi berdiri dan direndam dengan buffer elektroforesis. Kemudian marker dan sampel enzim
dimasukkan masing-masing sebanyak 7 µl pada sumur gel. Running elektroforesis dilakukan selama ±40 menit. Setelah itu gel dilepaskan dan direndam dalam
larutan commasie blue selama 30 menit. Gel yang telah direndam dalam larutan commasie blue diletakkan pada roker. Tahap selanjutnya gel dibilas dengan
aquades dan kemudian direndam kembali dalam larutan destaining selama 1 malam. Band atau pita protein dengan berat molekul berbeda akan terpisah. Hasil
yang diperoleh didokumentasikan melalui alat komputer dan multiscan.
3. Pengukuran Aktivitas Enzim Dische Borenfreund 1951
Tabel 4. Bahan-bahan yang dipersiapkan untuk uji aktivitas enzim
Bahan Blanko
Blanko substrat
Blanko enzim
Campuran reaksi
Aquades steril 225 µl
100 µl 175 µl
50 µl 1 M Buffer
25 µl 25 µl
25 µl 25 µl
100 mM Galaktosa -
125 µl -
125 µl
Enzim -
- 50 µl
50 µl Total
250 µl 250 µl
250 µl 250 µl
Larutan blanko, blanko substrat, blanko enzim dan campuran reaksi enzim+substrat dipersiapkan. Persiapan perlakuan tersebut dilakukan pada suhu
dingin untuk menginaktifkan reaksi enzimatis. Perlakuan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 60ºC selama 60 menit daan selanjutnya dimasukkan dalam
lemari pendingin selama 10 menit. Masing-masing perlakuan blanko, blanko substrat, blanko enzim dan campuran reaksi dimasukkan sebanyak 100 µl ke
dalam 900 µl larutan uji aktivitas tabel 5.
Tabel 5. Larutan uji aktivitas
Bahan Volume
10 mM Karbazol 30 µl
100 mM L-cystein 30 µl
9 M H
2
SO
4
900 µl
Total 960
29 Setelah dicampur dengan larutan uji aktivitas, masing-masing perlakuan
kemudian diinkubasi kembali pada suhu 60ºC selama 30 menit. Standar fruktosa juga diinkubasi dengan kondisi yang sama. Pengukuran aktivitas dilakukan
melalui absorbansi pada panjang gelombang 560 nm. Penentuan absorbansi dari tagatosa yang telah dibentuk dihitung dengan cara sesuai tabel berikut ini:
Perlakuan Absorbansi
Minus Blanko Reaksi
Blanko A
Blanko substrat B
B-A = E Blanko enzim
C C-A = F
Campuran reaksi D
D-A = G G – E+F = H
Kemudian nilai absorbansi H diplotkan pada kurva standar untuk
menentukan konsentasi mM atau M tagatosa produk yang terbentuk. Karena
konsentrasi yang terbentuk akibat dari 100 µl campuran dalam larutan uji aktivitas, sedangkan volume reaksi sendiri awalnya 250 µl, maka:
Pengukuran UAml untuk arabinosa isomerase dilakukan dengan menggunakan persamaan berikut:
4. Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford 1976. Protein sebanyak 50 µl direaksikan dengan 1.5 ml pereaksi Bradford,
kemudian divortex dan diinkubasi selama 2-5 menit pada suhu 37ºC. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Blanko menggunakan buffer Tris-HCl
yang direaksikan dengan 1.5 ml pereaksi Bradford. Standar protein menggunakan bovine serum albumin BSA pada kisaran 0 – 100 µg dari stock 2 mgml.
Penentuan kadar protein akan membantu untuk menghitung aktivitas spesifik enzim arabinosa isomerase. Aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim per
miligram protein.
UAml = 2.5 x Konsentrasi µM
60 menit x 50 µl x 10
-3
Konsentrasi x 250 µl = 2.5 x Konsentrasi
100 µl
30
5. Pehitungan Aktivitas Spesifik Enzim Rhimi Bejar 2006
