23 campuran pellet dan buffer tersebut diambil dan disimpan pada lemari pendingin.
Campuran pellet 1 P1 dan buffer ini disebut juga dengan total suspensi T. Sisa total suspensi T kemudian dipisahkan kembali untuk memperoleh supernatan 2
S2 dan pellet 2 P2 seperti yang akan dijelaskan pada tahapan purifikasi.
d. Optimasi produksi enzim pada medium ekpresi terpilih
Sebanyak 600 µl kultur E. coli transforman ditumbuhkan pada 60 ml medium ekpresi terpilih yang telah ditambahkan ampisilin dan kloramfenikol.
Setelah OD kultur mencapai 0.5-0.6, kemudian diinduksi dengan penambahan IPTG konsentrasi akhir IPTG pada medium = 1 mM. Sel dipanen setiap interval
0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 jam setelah induksi. Pengambilan total suspensi sel dilakukan dengan cara yang sama dengan yang telah diterangkan sebelumnya.
Setelah itu dilakukan pemisahan kembali dengan teknik freeze-thaw untuk
mendapatkan supernatan 2 S2 dan pellet 2 P2. Penentuan keberadaan enzim
dilakukan dengan perangkat gel elektroforesis SDS-PAGE. Sedangkan aktivitas
enzim diukur pada panjang gelombang 560 nm. 2. Purifikasi
a. Freeze-thaw
Total suspensi sel T atau campuran P1 dan buffer diberi perlakuan freeze-
thaw dengan cara memasukkannya pada freezer bersuhu -70 C sampai membeku
selama ± 30 menit dan mencairkannya kembali freeze-thaw dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 11,000 rpm suhu 4
C
selama 15 menit untuk memisahkan pellet 2 P2 dan supernatan 2 S2. Pellet 2 P2 ditambahkan buffer Tris HCl pH 7.5, sedangkan supernatan 2 S2
dimurnikan lebih lanjut. Penentuan keberadaan enzim AI dilakukan menggunakan
SDS-PAGE. Dan penentuan konsentrasi protein pada S2 ditentukan dengan
metode Bradford. Sedangkan aktivitasnya diukur pada panjang gelombang=560
nm setelah direaksikan dengan larutan pewarna sistein karbazol asam sulfat.
24
b. Heat treatment Lee et al 2004
Enzim dari supernatant 2 S2 atau enzim ekstrak kasar Crude Extract
[CE] dipanaskan dengan waterbath pada suhu 60ºC selama 30 menit. Dengan perlakuan panas heat treatment akan mendenaturasi protein lain yang tidak
tahan panas yang berikatan dengan enzim target. Setelah perlakuan heat treatment kemudian disentrifugasi pada kecepatan 11,000 rpm suhu 4 ºC selama 15 menit.
Supernatan yang diperoleh diambil S3, sedangkan pellet dibuang. Supernatan tersebut S3 dianalisis dengan SDS-PAGE, diukur aktivitasnya serta konsentrasi
proteinnya dengan metode Bradford. c. Kromatografi penukar anion
Cheng et al 2009
Pertama dilakukan bufferizing terhadap kolom kromatografi DEAE dengan buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.5. Suspensi enzim L-arabinosa isomerase hasil heat
treatment S3 diaplikasikan ke dalam kolom kromatografi DEAE. Protein dielusi
secara step wise menggunakan NaCl 0, 100, 300, 400, 500 mM dan 1 M dalam Tris-HCl pH 7.5 dengan kecepatan aliran 1 mLmenit. Fraksi ditampung dalam
tabung yang berbeda masing-masing sebanyak 2 mL. Kandungan protein yang terelusi masing-masing konsentrasi garam diukur dengan absorbansi sinar
ultraviolet UV pada panjang gelombang 280 nm. Sampel dengan nilai OD
280
tertinggi kemudian digunakan dalam elektroforesis SDS-PAGE. Protein yang telah dipurifikasi disimpan pada temperatur 4°C untuk kemudian diuji aktifitasnya
dan dikarakterisasi.
3. Karakterisasi a. Suhu optimum
