Listeriosis adalah infeksi serius yang disebabkan oleh L. monocytogenes
. L. monocytogenes dapat menyebabkan infeksi yang serius pada wanita hamil, bayi yang baru lahir, anak-anak, dan orang dewasa
yang sistem imunnya lemah Rocourt et al., 2000. Ciri-ciri listeriosis adalah demam, nyeri otot, dan kadang-kadang muntah atau diare. Jika
infeksi menyebar pada sistem saraf, muncul gejala seperti sakit kepala, leher kaku, kekacauan, hilang keseimbangan, dan sawan. Infeksi pada
wanita hamil dapat menyebabkan keguguran, prematur , atau infeksi pada bayi CDC, 2009.
Beberapa bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL memiliki aktivitas antagonis terhadap L. monocytogenes. Nisin memiliki aktivitas antagonis
terhadap L. monocytogenes dan aktivitasnya tergantung pada komposisi kimia makanan yang ditambahkan nisin. Pediocins dari Pediococcus
pentosaceus dan P. acidilactici dapat menghambat pertumbuhan L.
monocytogenes dan bakteriosin dari Lactobacillus bavaricus dapat
mempengaruhi pertumbuhan L. monocytogenes pada daging sapi yang disimpan di suhu rendah Rocourt dan Cossart, 1997.
2. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus berbentuk bulat; diameternya 0.5-1.5 μm;
koloni tunggal, berpasangan, atau bergerombol; Gram positif; tidak motil; tidak membentuk spora; anaerob fakultatif; kemoorganotrof; dan katalase
positif. Suhu optimum S. aureus adalah 30-37˚C. Bakteri ini umumnya diasosiasikan dengan kulit dan membran mukosa vertebrata berdarah
hangat, tetapi sering diisolasi dari makanan, debu dan air Holt et al., 1994.
S. aureus menghasilkan enterotoksin racun yang menyerang
saluran pencernaan. Makanan yang sering dianggap mengandung racun S. aureus
adalah daging dan produknya; unggas dan telur; salad seperti telur, tuna, ayam, kentang dan macaroni; produk bakery seperti kue berisi krim;
dan susu serta olahannya. Intoksikasi dapat terjadi karena menelan enterotoksin yang dihasilkan oleh beberapa strain S. aureus, pada
umumnya karena makanan tidak dijaga cukup panas 60˚C atau lebih atau cukup dingin 7.2˚C atau kurang FDA, 2009
b
. Gejala keracunan oleh Staphylococci biasanya cepat dan pada
banyak kasus bersifat akut. Hal ini tergantung pada tingkat kerentanan terhadap toksin, jumlah makanan terkontaminasi yang dimakan, jumlah
racun pada makanan, dan kondisi kesehatan korban. Gejala umumnya adalah muak, muntah, keram perut, dan lemah atau lesu. Pada kasus yang
lebih berat gejalanya adalah sakit kepala, keram otot, dan perubahan sementara pada tekanan darah. Dosis toksin kurang dari 1.0 μg pada
makanan yang terkontaminasi akan menimbulkan gejala intoksikasi. Toksin dihasilkan ketika populasi S. aureus melebihi 10
5
cfug FDA, 2009
b
.
3. Bacillus cereus
Bacillus cereus adalah bakteri Gram positif dengan flagella
peritrichous , berbentuk batang, membentuk spora, endospora berbentuk
oval, kemoorganotrof, dan umumnya katalase positif Holt et al., 1994. B. cereus
sudah ditentukan sebagai pembawa racun pada makanan sejak tahun 1955 Todar, 2008
a
. Terdapat 2 jenis penyakit yang disebabkan oleh B cereus : 1
muntah-muntah emetic yang disebabkan oleh peptida tahan panas dan berbobot molekul rendah, dan 2 diare yang disebabkan oleh protein
berbobot molekul besar FDA, 2009
c
. Waktu inkubasi untuk tipe emetic adalah 1-6 jam sedangkan waktu inkubasi untuk tipe diare adalah 8-16
jam. Penyebab penyakit tipe emetic adalah toksin emetic ETE dan mekanisme aksinya belum diketahui, sedangkan penyebab penyakit tipe
diare adalah enterotoksin Nhe atau enterotoksin hemolitik HBL yang mekanisme aksinya dengan membentuk lubang dan aktivasi enzim
adenylate cyclase Todar, 2008
a
. Berbagai macam makanan yang diasosiasikan dengan keracunan
makanan oleh B. cereus tipe diare yaitu daging, susu, sayuran, dan ikan. Tipe emetic pada umumnya diasosiasikan dengan nasi; makanan ber-pati
seperti kentang, pasta; dan keju FDA, 2009
c
.
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur bakteri asam laktat isolat ASI yang berpotensi sebagai probiotik sebanyak 24
isolat 23 isolat bersifat homofermentatif dan 1 isolat bersifat heterofermentatif.
BAL homofermentatif
yang digunakan
adalah Lactobacillus pentosus
A7, Lactobacillus rhamnosus A15, A23, A24, A29, A31, R21, R23, R24, R26, R34, B10, B16, Lactobacillus acidophillus1A8,
A22, Pediococcus pentosaceus2 A16, Lactobacillus rhamnosus2 B11, beberapa isolat yang belum diketahui genusnya A14, A27, R22, R25, R27,
B13, sedangkan BAL heterofermentatif yang digunakan adalah isolat A20 belum diketahui genusnya. Bahan-bahan lainnya adalah kultur bakteri uji
Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus, medium Man-Rogosa-Sharpe Agar MRSA Oxoid, Man-Rogosa-Sharpe-
Broth MRSB Oxoid, medium Nutrien Agar NA Oxoid, medium Nutrien Broth NB Oxoid, akuades, NaOH 1 N, alkohol, NaCl, buffer sitrat fosfat,
dan ammonium sulfat. Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik, neraca digital, hot
plate , autoklaf, vortex, pH meter, sentrifuse berpendingin Hermle Z 383 K,
syringe , membran filter 0.22 m, inkubator, refrigerator, jangka sorong,
spektrofotometer UV-2450, UV-VIS Spektrofotometer, mikropipet, tip berbagai ukuran dan alat-alat laboratorium berbahan gelas.
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu : 1 seleksi awal isolat bakteri asam laktat BAL potensi probiotik yang memiliki aktivitas
penghambatan tinggi terhadap bakteri Listeria monocytogenes dan 2 seleksi
BAL yang berpotensi menghasilkan bakteriosin. Tahap kedua terbagi menjadi 4 bagian, yaitu : a pengujian aktivitas antimikroba dengan metode kontak,
b penentuan fase stasioner, c mempelajari pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas antimikroba inkubasi BAL sampai kira-kira awal fase
stasioner dan membandingkannya dengan inkubasi BAL selama 24 jam, dan
d pengujian aktivitas antimikroba protein terendapkan presipitasi dengan ammonium sulfat. Gambaran umum penelitian dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 . Diagram Alir Penelitian
Seleksi awal BAL terhadap L. monocytogenes dengan metode difusi atau sumur agar 24 isolat BAL, inkubasi BAL selama 24 jam
Dipilih 50 BAL terbaik 12 isolat BAL
Pengujian aktivitas antimikroba supernatan bebas sel yang dinetralisasi terhadap
L. monocytogenes dengan metode kontak 12
isolat BAL, inkubasi BAL selama 24 jam Pengujian aktivitas antimikroba
supernatan bebas sel yang tidak dinetralisasi terhadap L. monocytogenes
dengan metode kontak 12 isolat BAL, inkubasi BAL selama 24 jam
Dipilih 50 BAL terbaik 6 isolat BAL Penentuan fase stasioner 6 isolat BAL
Pengujian aktivitas antimikroba supernatan bebas sel yang dinetralisasi terhadap B. cereus, S. aureus, dan L.
monocytogenes dengan waktu inkubasi BAL kira-kira
sampai awal fase stasioner metode difusi atau sumur agar, 6 isolat BAL
Pengujian aktivitas antimikroba supernatan bebas sel yang dinetralisasi terhadap L. monocytogenes dengan
waktu inkubasi BAL kira-kira sampai awal fase stasioner metode kontak, digunakan 2 isolat BAL
terbaik dari uji kontak sebelumnya isolat A7 dan R21 Pengujian aktivitas antimikroba protein terendapkan
terhadap B. cereus, S. aureus, dan L.monocytogenes dengan waktu inkubasi BAL kira-kira sampai awal fase stasioner
metode difusi atau sumur agar, digunakan 1 isolat BAL terbaik dari uji kontak yang pertama isolat R21
Dibandingkan dengan waktu
inkubasi BAL selama 24 jam
1. Seleksi Awal Isolat Bakteri Asam Laktat BAL Potensi Probiotik yang
Memiliki Aktivitas Penghambatan Tinggi terhadap Bakteri Listeria monocytogenes Garriga et al., 1993.
Kultur bakteri uji L. monocytogenes yang telah disegarkan selama 24 jam diinokulasikan sebanyak 0.2 ml kedalam 100 ml media NA konsentrasi
0.2 . Campuran media dan bakteri indikator digoyang-goyang supaya merata. Sebanyak ± 20 ml media NA yang telah terisi kultur uji dituang
kedalam cawan dan dibiarkan sampai memadat. Setelah memadat, dibuat sumur-sumur dengan diameter 6 mm. Sebanyak 30 l kultur bakteri asam
laktat yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam dimasukkan ke dalam sumur yang sudah dibuat, lalu cawan diinkubasi pada suhu 37˚C selama
1 hari. Zona penghambatan zona hambat = a - b mm
Keterangan : a = diameter zona bening yang terbentuk disekitar sumur mm
b = diameter sumur 6 mm Dipilih 50 isolat BAL yang memiliki aktivitas penghambatan tinggi
terhadap bakteri uji Listeria monocytogenes. Senyawa antimikroba yang mungkin dihasilkan pada tahap ini adalah asam organik, hidrogen peroksida
atau bakteriosin.
2. Seleksi BAL yang Berpotensi Menghasilkan Bakteriosin
