positif dan khususnya terhadap spesies yang berhubungan dekat dengannya De Vuyst dan Vandamme, 1994. Pengujian pada tahap selanjutnya adalah
untuk memperoleh isolat BAL yang berpotensi menghasilkan bakteriosin.
B. Seleksi BAL yang Berpotensi Menghasilkan Bakteriosin
1. Pengujian Aktivitas Antimikroba dengan Metode Kontak
Metode kontak adalah metode yang mengevaluasi aktivitas antimikroba berdasarkan perkembangan atau kematian bakteri dengan
mengukur jumlah bakteri setelah diberi sejumlah zat antimikroba dan dikontakkan pada waktu tertentu Fardiaz, 1989. Tujuan dari metode ini
adalah untuk mengetahui tingkat perkembangan atau kematian bakteri uji L. monocytogenes
setelah dikontakkan dengan supernatan bebas sel yang dinetralisasi dan tidak dinetralisasi selama waktu tertentu 8 jam.
Perkembangan atau kematian bakteri dinyatakan dalam nilai logaritma. Nilai logaritma dihitung dengan rumus log [NtNo], dengan Nt adalah jumlah
bakteri setelah waktu tertentu dan No adalah jumlah bakteri awal. Nilai logaritma negatif berarti bakteri uji L. monocytogenes mengalami kematian
setelah dikontakkan dengan supernatan yang diduga mengandung senyawa antimikroba dan sebaliknya.
Dua belas isolat BAL dari tahap sebelumnya A7, A15, A22, A24, R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, dan B16 diinkubasi selama 24 jam.
Bakteri L. monocytogenes dikontakkan dengan supernatan BAL bebas sel yang dinetralisasi dan tidak dinetralisasi. Tujuan penetralan adalah untuk
menghilangkan pengaruh asam organik. Jika terdapat penghambatan L. monocytogenes
pada supernatan bebas sel yang dinetralisasi maka senyawa yang diduga berperan adalah bakteriosin.
Penghambatan L. monocytogenes pada supernatan bebas sel yang dinetralisasi dan aktivitas bakterisidal terhadap L. monocytogenes pada
supernatan bebas sel yang tidak dinetralisasi dengan waktu inkubasi BAL selama 24 jam dapat dilihat pada Gambar 4. Data lengkap beserta
pertumbuhan L. monocytogenes pada MRSB kontrol dapat dilihat pada Lampiran 4.
Gambar 4. Perubahan jumlah L. monocytogenes pada supernatan bebas sel
yang dinetralisasi dan tidak dinetralisasi. Berdasarkan Gambar 4, terdapat 8 isolat BAL yang menunjukkan
aktivitas penghambatan terbaik terhadap L. monocytogenes pada supernatan bebas sel yang dinetralisasi yaitu : isolat A7, A15, A22, A24, R21, R24, R26
dan R27. Secara statistik, pertumbuhan L. monocytogenes pada kedelapan supernatan BAL tersebut berbeda nyata dengan pertumbuhan L.
monocytogenes pada MRSB atau kontrol Lampiran 5. L. monocytogenes
dapat tumbuh pada MRSB kontrol sebanyak 1.3 log sedangkan pertumbuhan L. monocytogenes
pada kedelapan supernatan isolat BAL tersebut lebih rendah yaitu berkisar antara 0.4-1.0 log. Hal ini menandakan masih terdapat senyawa
antimikroba pada supernatan bebas sel yang dinetralisasi kedelapan BAL tersebut. Senyawa antimikroba yang mungkin menghambat L. monocytogenes
pada kedelapan supernatan bebas sel tersebut adalah bakteriosin. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL dapat membunuh atau menghambat bakteri yang
berhubungan dekat dengannya yaitu bakteri gram positif seperti L. monocytogenes
. Kemungkinan terdapatnya senyawa antimikroba lain seperti CO
2
, diasetil, dan hidrogen peroksida sangat kecil. Kedelapan BAL yang menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap L. monocytogenes merupakan
bakteri homofermentatif sehingga kemungkinan terdapatnya CO
2
sangat kecil, CO
2
umumnya dibentuk oleh bakteri heterofermentatif. Kemungkinan terdapatnya senyawa diasetil juga sangat kecil karena produksi diasetil ditekan
pada fermentasi heksosa Ouwehand dan Vesterlund, 2004. Dari delapan
1.3 0.5
1.0 0.9
0.5 0.4
1.1 1.2
0.9 1.4
1.0 0.8
1.1
-2.6 -4.4 -4.5
-3.7 -4.7 -4.8
-4.2 -2.2
-4.0 -4.9
-2.0
-4.2 -6.0
-5.0 -4.0
-3.0 -2.0
-1.0 0.0
1.0 2.0
P e
ru b
ah an
J u
m lah
L .
m o
n o
c yt
o g
e n
e s
l o
g
N t
N o
Isolat BAL
dinetralisa si
isolat BAL yang menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap L. monocytogenes
, enam diantaranya adalah L. rhamnosus yaitu isolat A15, A24, R21, R24, R26 dan R27. L. rhamnosus kemungkinan tidak menghasilkan
H
2
O
2
seperti hasil penelitian Felten et al. 1999 yang menyatakan bahwa delapan belas isolat L. rhamnosus diketahui tidak dapat menghasilkan
hidrogen peroksida. Oleh karena itu, senyawa antimikroba yang diduga kuat menghambat L. monocytogenes pada supernatan bebas sel yang dinetralisasi
adalah bakteriosin. Aktivitas antimikroba pada supernatan bebas sel isolat BAL potensi
probiotik yang dinetralisasi tidak bersifat bakterisidal terhadap L. monocytogenes
. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh penggunaan hasil penyegaran BAL secara langsung sehingga senyawa antimikroba yang
dihasilkan tidak maksimal. BAL hasil penyegaran seharusnya ditumbuhkan kembali pada media baru agar pertumbuhan BAL dan senyawa antimikroba
yang dihasilkan maksimal. Selain itu, setiap BAL memiliki waktu inkubasi optimum serta kondisi pertumbuhan yang berbeda dalam menghasilkan
senyawa bakteriosin. Berdasarkan Gambar 4, aktivitas senyawa antimikroba pada
supernatan bebas sel yang tidak dinetralisasi bersifat bakterisidal terhadap L. monocytogenes
. Aktivitas bakterisidal terhadap L. monocytogenes disebabkan pada supernatan bebas sel yang tidak dinetralisasi masih terdapat senyawa
asam organik. Asam organik yang menghambat adalah asam laktat karena isolat BAL yang diuji bersifat homofermentatif. Fermentasi homofermentatif
menghasilkan asam laktat 90 Bogaert dan Naidu, 2000. Senyawa antimikroba pada supernatan bebas sel yang tidak
dinetralisasi memiliki kemampuan bakterisidal berbeda terhadap L. monocytogenes
. Penurunan jumlah L. monocytogenes berkisar antara 2.0-4.9 log. Kemampuan bakterisidal yang berbeda ini dapat disebabkan oleh banyak
sedikitnya asam laktat yang tidak terdisosiasi atau keberadaan senyawa antimikroba lain seperti bakteriosin.
Menurut Naidu dan Clemens 2000, asam lipofilik seperti asam laktat dapat berpenetrasi kedalam membran sel mikroba ketika dalam bentuk tidak
terdisosiasi. Pada menghasilkan ion
penting seperti tra Banyak s
dipengaruhi oleh supernatan yang ti
dapat dilihat pada
Gambar 5. Hubun
supernatan bebas selama 24 jam.
Berdasarka pH dan besarnya
lebih rendah belum Supernatan isolat
L. monocytogenes yang memiliki nil
menurunkan juml Hal ini memperkua
selain asam organi yang memiliki
monocytogenes l
da pH intraseluler yang lebih tinggi, asam a ion hidrogen yang akan mengganggu kegiata
translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif. sedikitnya asam laktat yang tidak terdi
eh pH. Hubungan pH dan kematian L. monoc g tidak dinetralisasi dapat dilihat pada Gambar
da Lampiran 6.
ubungan pH dan perubahan jumlah L. monoc as sel yang tidak dinetralisasi dengan waktu
rkan Gambar 5, tidak ada korelasi yang signifi ya kematian L. monocytogenes lampiran 7.
belum tentu dapat membunuh L. monocytogene R25 yang memiliki nilai pH 4.0 mampu menur
nes sebesar 4.3 log sedangkan supernatan isola
nilai pH lebih besar masing-masing yaitu 4.1 umlah L. monocytogenes lebih banyak yaitu 4.5
perkuat dugaan kemungkinan terdapat senyaw ganik pada supernatan A22 dan R21. Superna
ki pH lebih besar yaitu 4.9 juga dapat lebih banyak yaitu 3.7 log jika dibandi
akan terdisosiasi iatan metabolisme
erdisosiasi sangat onocytogenes
pada bar 5. Data lengkap
onocytogenes pada
ktu inkubasi BAL
nifikan antara nilai 7. Nilai pH yang
ogenes lebih banyak.
enurunkan jumlah olat A22 dan R21
4.1 dan 4.4 mampu 4.5 dan 4.7 log.
yawa antimikroba rnatan isolat A24
t membunuh L. ndingkan dengan
supernatan isolat R27 dan A7 yang memiliki nilai pH lebih kecil yaitu 4.4. Supernatan isolat R27 dan A7 masing-masing dapat menurunkan jumlah L.
monocytogenes sebesar 2.0 dan 2.6 log. Hal ini memperkuat dugaan
kemungkinan terdapat senyawa antimikroba selain asam organik pada supernatan A24. Nilai pH rendah dan dapat membunuh L. monocytogenes
lebih banyak terdapat pada supernatan R23, R25, dan B16. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh banyaknya asam tidak terdisosiasi pada
supernatan tersebut dan adanya senyawa antimikroba selain asam organik. Nilai pH lebih tinggi dan kemampuan membunuh L. monocytogenes yang
rendah terdapat pada supernatan A7 dan R27. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh sedikitnya asam yang tidak terdisosiasi pada supernatan
tersebut. L. monocytogenes
merupakan bakteri patogen penyebab listeriosis. Bakteri ini menjadi perhatian karena fatalnya akibat yang ditimbulkan dan
kemampuannya untuk tumbuh pada suhu rendah. Menurut FDA 2009
a
, L. monocytogenes
cukup tahan terhadap pembekuan, pengeringan dan pemanasan. Sifatnya yang demikian menyebabkan industri pangan memberi
perhatian khusus terhadap bakteri ini. Senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh BAL potensi probiotik diharapkan dapat melawan L. monocytogenes
sehingga dapat mengurangi terjadinya listeriosis.
2. Penentuan Fase Stasioner
