III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur bakteri asam laktat isolat ASI yang berpotensi sebagai probiotik sebanyak 24
isolat 23 isolat bersifat homofermentatif dan 1 isolat bersifat heterofermentatif.
BAL homofermentatif
yang digunakan
adalah Lactobacillus pentosus
A7, Lactobacillus rhamnosus A15, A23, A24, A29, A31, R21, R23, R24, R26, R34, B10, B16, Lactobacillus acidophillus1A8,
A22, Pediococcus pentosaceus2 A16, Lactobacillus rhamnosus2 B11, beberapa isolat yang belum diketahui genusnya A14, A27, R22, R25, R27,
B13, sedangkan BAL heterofermentatif yang digunakan adalah isolat A20 belum diketahui genusnya. Bahan-bahan lainnya adalah kultur bakteri uji
Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus, medium Man-Rogosa-Sharpe Agar MRSA Oxoid, Man-Rogosa-Sharpe-
Broth MRSB Oxoid, medium Nutrien Agar NA Oxoid, medium Nutrien Broth NB Oxoid, akuades, NaOH 1 N, alkohol, NaCl, buffer sitrat fosfat,
dan ammonium sulfat. Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik, neraca digital, hot
plate , autoklaf, vortex, pH meter, sentrifuse berpendingin Hermle Z 383 K,
syringe , membran filter 0.22 m, inkubator, refrigerator, jangka sorong,
spektrofotometer UV-2450, UV-VIS Spektrofotometer, mikropipet, tip berbagai ukuran dan alat-alat laboratorium berbahan gelas.
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu : 1 seleksi awal isolat bakteri asam laktat BAL potensi probiotik yang memiliki aktivitas
penghambatan tinggi terhadap bakteri Listeria monocytogenes dan 2 seleksi
BAL yang berpotensi menghasilkan bakteriosin. Tahap kedua terbagi menjadi 4 bagian, yaitu : a pengujian aktivitas antimikroba dengan metode kontak,
b penentuan fase stasioner, c mempelajari pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas antimikroba inkubasi BAL sampai kira-kira awal fase
stasioner dan membandingkannya dengan inkubasi BAL selama 24 jam, dan
d pengujian aktivitas antimikroba protein terendapkan presipitasi dengan ammonium sulfat. Gambaran umum penelitian dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 . Diagram Alir Penelitian
Seleksi awal BAL terhadap L. monocytogenes dengan metode difusi atau sumur agar 24 isolat BAL, inkubasi BAL selama 24 jam
Dipilih 50 BAL terbaik 12 isolat BAL
Pengujian aktivitas antimikroba supernatan bebas sel yang dinetralisasi terhadap
L. monocytogenes dengan metode kontak 12
isolat BAL, inkubasi BAL selama 24 jam Pengujian aktivitas antimikroba
supernatan bebas sel yang tidak dinetralisasi terhadap L. monocytogenes
dengan metode kontak 12 isolat BAL, inkubasi BAL selama 24 jam
Dipilih 50 BAL terbaik 6 isolat BAL Penentuan fase stasioner 6 isolat BAL
Pengujian aktivitas antimikroba supernatan bebas sel yang dinetralisasi terhadap B. cereus, S. aureus, dan L.
monocytogenes dengan waktu inkubasi BAL kira-kira
sampai awal fase stasioner metode difusi atau sumur agar, 6 isolat BAL
Pengujian aktivitas antimikroba supernatan bebas sel yang dinetralisasi terhadap L. monocytogenes dengan
waktu inkubasi BAL kira-kira sampai awal fase stasioner metode kontak, digunakan 2 isolat BAL
terbaik dari uji kontak sebelumnya isolat A7 dan R21 Pengujian aktivitas antimikroba protein terendapkan
terhadap B. cereus, S. aureus, dan L.monocytogenes dengan waktu inkubasi BAL kira-kira sampai awal fase stasioner
metode difusi atau sumur agar, digunakan 1 isolat BAL terbaik dari uji kontak yang pertama isolat R21
Dibandingkan dengan waktu
inkubasi BAL selama 24 jam
1. Seleksi Awal Isolat Bakteri Asam Laktat BAL Potensi Probiotik yang