Uji Serologi
f. Uji Serologi
Uji ELISA (Enzyme-Linked Immuno-sorbent Assays) adalah pengujian serologi terutama digunakan untuk mendeteksi bakteri dan virus terbawa benih. Prinsip pengujian tersebut adalah reaksi in vitro antara antigen dan antibodi. Dalam pengujian cara ini sangat tergantung kepada ketersediaan sejumlah antibodi yang spesifik untuk patogen sasaran. Uji ELISA sebagai salah satu metode serologi untuk mendeteksi virus sering digunakan karena metode tersebut sederhana, mudah dilakukan, cepat, sensitif, akurat, dan dapat digunakan untuk menguji sampel dalam jumlah besar. Metode tersebut berdasarkan pada konjugasi antara virus– antibodi dan enzim, dengan menambahkan substrat pewarna maka adanya konjugasi tersebut dapat diperlihatkan.
Dalam uji ELISA ada beberapa cara yang digunakan yaitu indirect ELISA, double antibody sandwich ELISA (DAS ELISA), DAS ELISA protocol, F (ab’) 2 indirect ELISA dan
F (ab’)2 ELISA protocol, tetapi yang banyak digunakan adalah metode indirect ELISA dan double antibody sandwich ELISA (DAS ELISA). Dalam indirect ELISA uji didasarkan pada adanya ikatan enzim dengan molekul antibody yang dapat dideteksi oleh antiviral immunoglobulin. Sedangkan pada DAS ELISA, virus diikat oleh antibody spesifik yang kemudian bereaksi lagi dengan antibody spesifik yang telah diikat oleh enzim.
Dari segi praktikal indirect ELISA lebih sederhana dan lebih cepat karena dalam indirect ELISA tidak Dari segi praktikal indirect ELISA lebih sederhana dan lebih cepat karena dalam indirect ELISA tidak
lubang plate ELISA. Inkubasikan plate globulin (lgG), dan mela-kukan
tersebut selama 1 jam pada suhu konjugasi enzim–immuno-globulin.
37 o C.
Prosedur uji serologi adalah Secondary antiserum (conjugate) sebagai berikut: Antigen (ekstrak
harus disiapkan setelah primery tanaman yang diuji) harus
antiserum yaitu dengan cara: dipersiapkan terlebih dahulu
Kosongkan plate ELISA dan cuci (Persiapan kontrol) yaitu ekstrak
dengan cara seperti di atas. Masukan tanaman sehat dan suspensi tanaman
konjugasi antibody– Alkaline yang positif terinfeksi virus dalam
phosphatase (tersedia secara antigen buffer dengan pengenceran
komersial sebagai SWAREC = Swine 1/50. Buat ekstrak antigen dengan
antirabbit enzyme conju-gate) pada cara menggerus jaringan tanaman
pengenceran 1/1000–1/2000 dalam yang akan diuji kemudian diencerkan
serum buffer. Inkubasikan selama 1 dengan antigen buffer dengan
jam pada suhu 37 o C. pengenceran 1/9. Masukan antigen
Substrat dibuat setelah antiserum tersebu sebanyak 100 µl pada setiap
siap untuk digunakan. Metoda lubang plate ELISA.
pembuatan substrat adalah sebagai Tutup plate ELISA dengan plastik
berikut: Kosongkan plate ELISA dan tipis dan diinkubasikan selama 1 jam
cuci sebagaimana di atas. Buat pada suhu tumbuh 37o C atau
larutan substrat dari 1 tablet p– semalaman pada suhu kamar.
nitrophenyl (PNPP), (tersedia se-cara Primary (specific antiserum) harus
komersial) dalam 10–15 ml disiapkan terlebih dahulu. Selama
diethanolamine buffer (DIEAB). inkubasi (atau sebelum uji dimulai)
Masukan substrat tersebut 100 µl per dapat dilakukan cross–adsorbtion
lubang. Inkubasikan selama 30 menit antiserum dengan jaringan sehat
pada suhu kamar. Reaksi positif yaitu dengan cara sebagai berikut. apabila terjadi perubahan warna
Jaringan sehat dihancurkan dalam
menjadi kuning.
serum buffer dengan pengeceran Baca nilai absorban ultra violet 1/20. Suspensi disaring dengan
dengan menggunakan alat spektro- menggunakan kain kasa. Encerkan
fotometer. Untuk menghentikan reaksi anti-serum sesuai anjuran dalam
dapat dilakukan dengan menambah suspensi tersebut. Aduk sampai rata
setetes 3 N NaOH pada tiap lubang. dan inkubasi selama 45 menit pada suhu 37 o C. Cara Pembuatan Buffer untuk Inderect Pencucian dilakukan dengan
ELISA : langkah-langkah sebagai berikut. PBS (Phosphate Buffered Saline) :
Kosongkan plate ELISA. Cuci plate
a. 0,05 M KH2 PO4 / Na2 HPO4 + ELISA dengan PBS Tween, rendam
8,5 g Na Cl /l
selama 3 menit dengan PBS Tween,
b. pH 7,2
ulangi sampai 4 kali cucian. Keringkan dengan kertas tissue. Masukan
Antigen buffer: kesehatan benih adalah Polymerase
i. PBS + 0,01 M NaDIECA. chain reaction (PCR). Teknik PCR mempunyai tingkat ketelitian yang
PBS Tween (untuk mencuci) sangat tinggi dan dapat dilakukan • 1 liter PBS Tween
dalam waktu yang relatif singkat. • 0,2 g KCl.
Tetapi penggunaan teknik PCR untuk • 0,5 ml Tween 20
pengujian rutin kesehatan benih masih terlalu mahal dalam hal bahan,