al . 2006. Website ini juga memiliki link dengan web database DNA lainnya.
Beberapa pusat riset di dunia telah melakukan upaya genome sequencing yang datanya dapat diakses secara bebas. Manipulasi dan analisis DNA dapat dilakukan
secara on line atau off line internet Purwantomo, 2006
2.2. Kloning Gen DNA
Kloning DNA umumnya adalah perbanyakan DNA rekombinan, yaitu DNA yang sudah direkayasa dengan teknik penggabungan atau penyisipan gen DNA
dari organisme satu ke dalam genom organisme lain transplantasi genteknologi plasmid. Contohnya : kloning gen penghasil insulin dari kelenjar pankreas
manusia, disisipkan ke dalam plasmid bakteri E.coli, sehingga bakteri dapat mengekspresikan gen tersebut dan menghasilkan insulin manusia dalam jumlah
yang banyak, mengingat bakteri sangat cepat membelah diri dan bertambah banyak dengan cepat.
Bioteknologi telah lebih banyak menggunakan sumber genetik DNA organisme yang telah dimanipulasi dan disebut dengan rekayasa genetika.
Rekayasa genetika telah memungkinkan para ilmuwan untuk memodifikasi gen- gen spesifik dan memindahkannya di antara organisme yang berbeda. Menurut
Ratnasari 2007 mekanisme penyisipan gen DNA adalah sebagai berikut : 1. DNA yang ingin disisipkan, diisolasi dan dipotong oleh enzim restriksi
endonuklease, di tempat yang urutan nukleotidanya spesifik. 2. Plasmid bakteri E.coli, diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama.
Plasmid ini biasanya disebut sebagai vektor pengklon.
7
3. Fragmen DNA kemudian disisipkan ke dalam vektor dan disatukan oleh enzim ligase.
4. Plasmid yang telah disisipi, dimasukkan kembali ke dalam bakteri, kemudian bakteri tersebut dikembangbiakan menjadi banyak, sehingga
rekombinan pun ikut bertambah banyak, demikian pula hasil ekspresi gennya.
2.2.1. Plasmid Plasmid adalah molekul DNA sirkular ynag terdapat bebas dalam sel
bakteri. Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih dan sering kali gen tersebut menyebabkan adanya ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri tuan
rumah. Sebagai contoh, kemampuan hidup di dalam antibiotik dengan konsentrasi yang biasanya toksik seperti kloramfenikol dan ampisilin sering digunakan
sebagai suatu selectable marker untuk memastikan bahwa bakteri dalam kultur mengandung gen tertentu Brown, 1991.
Semua plasmid memiliki paling sedikit satu urutan rangkaian DNA yang dapat bertindak sebagai asal replikasi, sehingga plasmid-plasmid itu mampu
memperbanyak diri di dalam sel Brown, 1991. 2.2.2. Ligasi dan Penyisipan Gen
Untuk membuat DNA rekombinan, setidaknya digunakan dua macam enzim yaitu enzim endonuklease yang berfungsi sebagai pemotong DNA. Karena
fungsinya, enzim ini sering disebut sebagai enzim pemotong restriction enzyme. Enzim lainnya adalah enzim ligase yang berfungsi menggabungkan molekul DNA
8
yang sudah terpotong ke molekul DNA lain. DNA vektor dipotong pada bagian yang dikehendaki untuk disisipi DNA asing, Adapun DNA asing yang akan
disisipkan juga dipotong sesuai yang dikehendaki. Pemotongan dan penggabungan molekul DNA dilakukan secara in vitro Muladno, 2002.
2.2.3. Transformasi Transformasi merupakan proses pemasukan molekul DNA ke dalam sel.
Sel yang digunakan dalam proses transformasi ini biasanya disebut dengan sel kompeten. Dalam proses transformasi, sel kompeten yang dicampur dengan
molekul DNA hasil penggabungan akan mengalami tiga kemungkinan, yaitu : 1. Sel kompeten tidak kemasukan molekul DNA apapun,
2. Sel kompeten kemasukan DNA vektor yang tidak membawa gen asing, 3. Sel kompeten kemasukan molekul DNA vektor yang membawa gen
rekombinan. Untuk mengetahui ketiga kemungkinan yang terjadi pada sel kompeten, tiga
cawan yang berisi media padat disiapkan, yang masing-masing dilabel A, B,C. Cawan A hanya berisi media padat, cawan B berisi media padat yang
mengandung antibiotik, cawan C berisi media padat yang mengandung antibiotik, X-Gal, dan IPTG. Masing-masing cawan digunakan untuk
menumbuhkan sel kompeten hasil transformasi. Ketika sel ditumbuhkan pada ketiga cawan tersebut, jumlah koloni terbanyak didapat pada cawan A, karena
semua sel kompeten dapat hidup semua. Pada cawan B, jumlah koloni jauh lebih sedikit daripada jumlah koloni pada cawan A karena semua sel kompeten kosong
9
akan mati. Hanya koloni sel pembawa DNA plasmid yang dapat hidup karena pada plasmid mengandung gen tahan terhadap antibiotik. Pada cawan C jumlah
koloni relatif sama dengan jumlah koloni pada cawan B tetapi ada dua macam warna koloni, yaitu putih dan biru. Adanya perbedaan warna koloni ini terjadi
akibat adanyazat kimia X-Gal dan IPTG yang bereaksi dengan produk gen LacZ pada plasmid. Warana putih pada koloni diakibatkan adanya kerusakan pada gen
LacZ yang disisipi oleh gen asing. Dengan kata lain, koloni berwarna putih
berarti sel kompeten membawa DNA rekombinan DNA plasmid+gen asing. Adapun koloni berwarna biru berarti sel kompeten yang tumbuh di cawan hanya
membawa DNA plasmid saja tidak tersisipi gen asing Muladno, 2002. Menurut Mizawarti 2003, setelah proses transformasi berlangsung di dalam
bakteri inang, vektor menggandakan replikasi menghasilkan banyak salinan atau turunan yang identik, baik vektornya maupun gen yang dibawanya.
2.3. Polymerase Chain Reaction PCR
