Prosedur Kerja METODE PENELITIAN

3.3. Prosedur Kerja

3.3.1. Studi Bioinformatika Studi Bioinformatika dimulai dengan pencarian sekuens basa nukleotida dan rangkaian asam amino dari bakteri sumber gen xylA L.pentosus melalui Genebank online NCBI National Center for Biotechnology Information. Selain itu dengan menggunakan program BLAST Basic Local Allignment Search Tool pada Genebank tersebut, maka akan diketahui beberapa bakteri yang memiliki gen xylA selain L.pentosus lengkap dengan sekuens basa nuklotida dan rangkaian asam aminonya, sehingga dapat diketahui tingkat homologi antar bakteri yang memiliki gen xylA. 3.3.2. Desain Primer Desain primer dibuat dari sekuens gen xylA L.pentosus dengan menggunakan program Genamics Expression Lampiran 6 dan dikalkulasi dengan DNA calculator online Lampiran 9 untuk mengetahui potensial pembentukan hairpin dan self-annealing primer. Software FastPCR in silico Lampiran 8 digunakan untuk memprediksi produk PCR berdasarkan primer yang telah didesain dan untuk mengetahui spesifikasi primer. 3.3.3. Preparasi a. Sterilisasi Bahan dan alat yang akan digunakan dalam penelitian dicuci bersih dan disterilisasi. Cara sterilisasi yang digunakan yaitu metode sterilisasi kering dengan menggunakan oven pada suhu 150°C selama 2 jam dan metode sterilisasi basah dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C pada tekanan 1 atm selama 30 menit. 22 b. Pembiakan Bakteri Biakan L.pentosus dikultur dalam media MRS Oxoid dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam secara anaerobik. Biakan E.coli dikultur dalam media LB Luria Bertani dan diinkubasi dalam inkubator shaker 150 rpm pada suhu 37°C selama 16 jam. 3.3.4. Isolasi Genom Proses isolasi genom akan dilakukan dengan menggunakan Genomic DNA Purification Kit dari Fermentas. Kultur L.pentosus sebanyak 1,5 ml dalam media cair dipindahkan ke dalam tabung steril dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Pelet yang didapatkan dari perlakuan tersebut ditambahkan dengan 200µl buffer TE, divorteks dan dibolak-balik hingga homogen. Larutan ditambah 400µl lysis solution dan diinkubasi dalam waterbath 65 o C selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 600µl kloroform, dibolak-balik 3- 5 kali dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Fase paling atas Upper Aqueus Layer diambil, dipindahkan ke tabung 1,5ml baru, ditambah 800µl larutan presipitasi, dibolak-balik selama 2 menit dan disentifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Larutan kemudian ditambahkan 100µl larutan NaCl, divorteks dan ditambahkan 300µl EtOH 100. Larutan diinkubasi selama 2 jam pada suhu -20 o C. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang, supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan pengering vakum. Pelet ditambah 30 µ l larutan RNAse dalam buffer TE dan diinkubasi pada suhu 37 o C 23 selama 1 jam. Hasil isolasi genom dicek dengan elektroforesis menggunakan agarosa 1 dalam buffer TBE dan Gene Ruler 1kb DNA Ladder sebagai penanda marker dan divisualisasi di bawah sinar UV. 3.3.5. Kloning Gen xylA a. Amplifikasi Sekuens DNA Target dengan Metode PCR Amplifikasi sekuens xylA dilakukan dengan menggunakan DNA Cloning Kit dari fermentas. Campuran reaksi PCR dibuat dalam volume 50µl dan disesuaikan dengan rekomendasi dari produsen untuk tujuan optimasi. Komposisinya adalah sebagai berikut: Tabel 1. Komposisi Reaksi PCR Komposisi dalam Reaksi PCR Konsentrasi Akhir Volume yang Ditambahkan Larutan dNTPmix 10mM 0,2 mM 5 µl Larutan MgCl 2 25mM 2 mM 4 µl Primer forward 100 µM 2 µ M 1 µl Primer reverse 100 µM 2 µ M 1 µl 10 x buffer Taq DNA polymerase 1 x 5 µl Taq DNA Polymerase 1,25 u50µ l 0,25 µl DNA template 1 ng 1 µl dH 2 O - 32,75 µ l Volume Total 50 µl Semua komponen PCR tersebut disiapkan di atas es dalam sebuah tabung PCR ukuran 250µl dan komponen larutan dalam tabung PCR dicampur hingga homogen, lalu disentrifugasi hingga seluruh larutan terbawa ke dasar tabung. Tabung PCR kemudian diletakkan ke dalam thermocycler otomatis Perkin Elmer GeneAmp® PCR System . Proses PCR akan dilakukan dengan kondisi sebagai berikut: 24 Tabel 2. Kondisi Reaksi PCR Kondisi reaksi PCR Suhu °C Waktu Denaturasi awal Initial Denaturation 94 2 menit Denaturasi Denaturation 94 30 detik Penempelan primer Primer Annealing 52 30 detik Pemanjangan Extending 72 1 menit Akhir pemanjangan Final extending 72 7 menit Sebanyak 35 siklus Cek hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 dalam buffer TBE dan Gene Ruler 1kb DNA Ladder. b. Purifikasi Produk PCR Proses purifikasi akan dilakukan dengan menggunakan Gel Extraction Kit dari Bio Basic Inc. Produk PCR sebanyak 40µl ditambah dengan 120 µl Binding buffer II dibolak-balik dan dimasukkan dalam EZ-10 Column+Collection tube lalu didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang. Proses sentifugasi dilakukan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan dari Collection tube dan ditambahkan 500µl Wash solution kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan dari Collection tube dan dilakukan sentrifugasi dengan kondisi yang sama. EZ-10 Column dipindahkan dari Collection tube ke tabung steril dan ditambahkan dengan 30µl Elution buffer tepat di tengah-tengah kolom. Campuran di dalam tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang. c. Ligasi Produk PCR ke dalam Plasmid pGEM-T Easy Proses ligasi dilakukan dengan menggunakan T4 DNA Ligase dari Fermentas. Komposisi reaksi ligasi sebagai berikut: 25 Tabel 3. Komposisi Reaksi Ligasi Komposisi dalam Reaksi Ligasi Volume yang Ditambahkan Produk PCR 50 ng L 7 L Plasmid pGEM-T Easy 50 ng L 1 L 2x Rapid Ligation Buffer 9 µ L Enzim T4 DNA Ligase 3 weiss units L 1 µ L Volume total 18 µ L Masing-masing komposisi dimasukkan dalam tabung 1,5 ml. Proses pencampuran dilakukan di atas es. Setelah semua larutan berada dalam kondisi homogen, maka akan dilakukan inkubasi pada suhu 4°C selama 24 jam. d. Sel Kompeten E.coli DH5 dan Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam Bakteri Inang E.coli DH5 Persiapan sel kompeten E.coli DH5 dilakukan dengan metode CaCl 2. Hasil kultur E.coli DH5 sebanyak 3 mL yang telah diinkubasi 37°C , 200 rpm Overnight , diambil 500µl kemudian dimasukkan ke dalam media LB 50 mL, lalu diinkubasi kembali pada 37°C, 200 rpm selama 3 jam hingga nilai OD 0,6-1. Selanjutnya kultur E.coli DH5 tersebut dipindahkan ke dalam tabung sorval dan diinkubasi 10 menit di atas es. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Pelet yang didapat ditambahkan dengan 20 mL larutan B dan dicampurkan hingga pelet lepas. Kemudian diinkubasi selama 30 menit di atas es lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Pelet diambil dan dicampurkan dengan 2 mL larutan B, divorteks dan diinkubasi kembali diatas es selama 15 menit sebelum digunakan untuk proses tranformasi selanjutnya. Proses transformasi akan dilakukan dengan metode Heat Shock menurut Sambrook et al 1989. Prosedur kerjanya sebagai berikut: 26 Ligation mix baik untuk produk PCR maupun kontrol sebanyak 4µ l ditambah dengan sel kompeten E.coli DH5 sebanyak 50µl dimasukkan dalam tabung steril 1,5 ml dan dilakukan proses inkubasi selama 30 menit dalam es. Heat Shock dilakukan pada suhu 42°C dalam waterbath selama 100 detik dan secara cepat langsung diinkubasi dalam es selama 2 menit. Media LB sebanyak 950µl ditambahkan ke dalam campuran dan dilakukan inkubasi dalam inkubator shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 2 jam pada suhu 37°C. Hasil transformasi sebanyak 40µl dipindah ke dalam media LB padat yang telah diberi antibiotik ampisilin, IPTG dan X-Gal solution. Proses inkubasi akan dilakukan selama 16 jam pada suhu 37°C. e. Isolasi Plasmid pGxylA dari Bakteri Rekombinan E.coli DH5 Persiapan dilakukan dengan mengisolasi koloni tunggal yang berwarna putih dari bakteri rekombinan E.coli DH5 pada medium LB padat yang telah ditambahkan ampisilin menggunakan tip steril. Koloni tunggal diambil dengan menggunakan tip steril dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 3 ml medium LB cair yang telah ditambahkan ampisilin. Inkubasi dilakukan dengan menggunakan inkubator shaker kecepatan 250 rpm selama 16 jam pada suhu 37 o C. Proses isolasi plasmid dimulai dengan melakukan sentrifugasi kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 o C selama 10 menit terhadap kultur bakteri yang telah dipindahkan ke dalam tabung 1,5ml steril hingga didapatkan pelet pada dasar tabung. Pelet ditambah dengan larutan I sebanyak 100µl, divorteks hingga homogen dan diinkubasi dalam es selama 5 menit. Larutan ditambah dengan larutan II sebanyak 200µ l, dibolak-balik hingga keruh dan diinkubasi dalam es 27 selama 5 menit. Larutan ditambah dengan larutan III sebanyak 150µl, dibolak- balik hingga terbentuk endapan putih dan diinkubasi dalam es selama 5 menit. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung steril 1,5 ml dan ditambah etanol 100 sebanyak 900µl. Larutan divorteks hingga homogen dan diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dibuang, pelet dikeringkan dan ditambah dengan etanol 70 dingin sebanyak 1ml. Larutan divorteks hingga endapan lepas dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh dikeringkan dengan pengering vakum dan dilarutkan dengan 30µl larutan RNAse dalam buffer TE serta diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 jam. f. Pemotongan Digesti Plasmid pGxylA dengan Enzim Restriksi Proses ini dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI dari Fermentas. Komposisi reaksi dalam volume 5µl adalah sebagai berikut: Tabel 4. Komposisi Reaksi Enzim Restriksi EcoRI Komposisi dalam Reaksi Volume yang Ditambahkan Enzim 10 x EcoRI 0,5 µ L Buffer 10 x EcoRI 0,5 µ L Plasmid pGxylA 4 µ L Volume total 5 µ L Campuran dimasukkan dalam tabung steril 250µl dan diinkubasi pada waterbath 37°C selama 2 jam. Cek hasil digesti plasmid pGxylA dilakukan 28 dengan elektroforesis menggunakan agarose 1 dalam buffer TBE dan Gene Ruler 1kb DNA Ladder Marker. g. Elektroforesis dengan Gel Agarosa Dilarutkan 5 gr bubuk agarosa ke dalam tabung erlenmeyer yang telah berisi 50ml larutan buffer TBE, kemudian dipanaskan campuran hingga semua agarosa larut dan larutan menjadi bening. Didinginkan larutan hingga mencapai suhu 60°C, selanjutnya dipasang sisir pembentuk sumur di atas tempat pencetak gel, lalu secepatnya larutan agarosa yang hangat dituang ke dalam cetakan. Dipastikan jangan sampai ada gelembung udara di bawah atau diantara ruas-ruas dari tempat pencetak gel. Dibiarkan gel mengeras sekitar 30-40 menit pada suhu ruang, lalu diangkat sisir pembentuk sumur dan diletakan gel pada tangki elektroforesis dan ditambahkan larutan buffer TBE sampai larutan buffer menutupi seluruh permukaan gel. Dicampur 5µ l DNA dengan 1µl buffer loading dye , lalu dibuat campuran untuk penanda 1µl buffer loading dye, 4µl akuades, 1µl Gene Ruler 1kb DNA Ladder Marker. Dimasukkan campuran-campuran tersebut ke dalam sumur pada gel secara perlahan dengan menggunakan mikropipet ukuran 10µ l. Selanjutnya ditutup tangki elektroforesis dengan penutupnya kemudian dihubungkan dengan arus listrik pada tegangan 135 volt selama 20 menit. Setelah itu, dilakukan pewarnaan gel dengan Et-Br. h. Pewarnaan Gel dengan Ethidium Bromida Et-Br dan Pemotretan dengan Sinar Ultra Violet UV. Direndam gel dalam air yang mengandung Et-Br 0,1µlml selama 30-45 menit pada suhu ruang. Selanjutnya dilakukan pemotretan gel dengan 29 menggunakan sinar ultra violet, yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah digunakan pelindung mata untuk menahan sinar UV karena radiasi sinar UV sangat berbahaya. Lalu hasil floresensi pita-pita difoto dengan menggunakan kamera digital. 30 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Bakteri Sumber Gen