elongasi elongation, yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis
DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas
baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya Muladno, 2002.
Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan dalam penelitian biologis kedokteran, sosial, dan hukum. PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku
kejahatan dari sampel DNA air mani, darah atau jaringan tubuh pelaku lainnya, atau PCR ini digunakan untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi, seperti
DNA virus HIV Ratnasari, 2007.
2.4. Elektroforesis Agarosa
Pada prinsipnya, DNA dapat bermigrasi di dalam gel dalam bentuk padat yang diletakkan dalam larutan penyangga yang dialiri arus listrik. Secara fisik,
agarosa tampak seperti bubuk putih yang sangat halus. Agarosa yang dijual, secara komersial terkontaminasi dengan polisakarida, garam dan protein.
Besarnya kontaminasi dalam gel dapat mempengaruhi migrasi DNA di dalam gel dapat mempengaruhi migrasi DNA di dalam gel dan kemampuan mengambil
DNA dari dalam gel untuk digunakan sebagai substrat dalam reaksi enzimatis. Gel agarosa dapat dicetak dengan memanaskan agarosa yang dilarutkan dalam
larutan buffer hingga didapatkan larutan yang jernih. Larutan yang masih cair dengan suhu 60
o
C dituangkan ke dalam pencetak gel. Segera setelah itu, sisir ditempatkan di dekat tepian gel dan gel dibiarkan mengeras. Kepadatan gel
12
bergantung dari persentase agarosa di dalam larutan tadi. Apabila gel telah mengeras, sisir dicabut sehingga akan terbentuk sumur-sumur yang digunakan
untuk menempatkan larutan DNA Muladno, 2002. Elektroforesis agarosa digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan
ukurannya. DNA bermuatan negatif, maka DNA akan bergerak ke kutub positif pada daerah yang dipengaruhi oleh arus listrik. DNA yang ukurannya lebih kecil
akan bergerak lebih cepat dibandingkan DNA yang ukurannya lebih besar. Hasil dari elektroforesis gel agarosa ini adalah berupa pita-pita. Gel agarosa pada
elektroforesis ini merupakan polimer dari D-galaktosa dan 3,6 Anhidro-L- galaktosa yang dalam keadaan gel akan berikatan silang satu sama lain, sehingga
seakan-akan membentuk jaring yang akan menyeleksi DNA yang melewati gel agarosa. DNA merupakan molekul yang sulit dilihat dengan mata, sehingga
membutuhkan molekul yang dapat membantu untuk melihat DNA. Etidium bromida Et-Br adalah salah satu molekul yang dapat membantu visualisasi
DNA. Et-Br dalam DNA mampu menghasilkan fluoresensi bila disinari dengan ultra violet. Karena Et-Br menyisip pada DNA maka posisi DNA dapat diketahui.
Kompleks Et-Br dan DNA memiliki spektrum fluoresensi dengan panjang gelombang maksimum 302 nm. Fluoresensi kompleks DNA-Et-Br 10 kali lipat
lebih besar dibandingkan DNA tanpa Et-Br. Diperkirakan sinar ultra violet yang diserap oleh DNA ditransfer ke ikatan Et-Br dan diemisikan kembali pada panjang
gelombang yang lebih tinggi. Kompleks Et-Br DNA pada gel juga memberikan latar fluoresensi. Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di
antaranya adalah,
13
1. Ukuran molekul DNA. Migrasi molekul DNA yang berukuran besar, akan lebih lambat bermigrasi dibandingkan molekul DNA yang berukuran kecil.
2. Konsentrasi agarosa. Migrasi molekul DNA pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi
tinggi. Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarosa dalam membuat gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA yang akan dianalisis.
3. Voltase yang digunakan. Pemisahan molekul DNA di dalam gel akan
menurun jika pada waktu pengukuran menggunakan voltase yang terlalu tinggi.
4. Adanya etidium bromida di dalam gel. Ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA sebesar 15. Larutan ini sangat
berbahaya dan bersifat karsinogenik. 5. Komposisi larutan buffer. Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan,
maka aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat, sedangkan larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas
sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.
2.5. Enzim Xilosa Isomerase XI
